INVESTIGADORES
ROMANUTTI Carina
congresos y reuniones científicas
Título:
Estudio epidemiológico molecular del gen de la proteína de Fusión en cepas argentinas del Virus Distemper Canino
Autor/es:
ROMANUTTI CARINA; GALLO CALDERÓN MARINA; KELLER LETICIA; MATTION NORA; LA TORRE JOSE
Lugar:
Mar del Plata
Reunión:
Jornada; VIII Jornadas internacionales de veterinaria practica.; 2013
Institución organizadora:
Colegio de Veterinarios de la Pcia. de Bs. As.
Resumen:
INTRODUCCION: El Virus Distemper Canino (VDC), miembro del género Morbillivirus, familia Paramyxoviridae, es altamente contagioso y de distribución mundial. Afecta a animales de compañía y a especies silvestres susceptibles tales como visones, hurones, zorros, etc, causando una típica infección aguda generalizada que se caracteriza por la replicación viral en células del sistema linfoide, con la subsecuente diseminación a los tejidos de todo el cuerpo. Siendo generalmente fatal en huéspedes susceptibles debido a su alta neurovirulencia e inmunosupresión, lo cual favorece la infección por otros patógenos (1). Las vacunas a virus vivo modificadas desarrolladas en la década del 60 lograron controlar la enfermedad, pero recientemente se han registrado a nivel mundial y en Argentina un aumento de casos de VDC tanto en animales vacunados como en animales no vacunados (2-4). La diversidad genética en los genes codificantes para las proteínas de la envoltura viral, la Hemaglutinina (H) y la proteína de Fusión (F), estaría relacionada con el incremento en la incidencia del VDC y permite establecer relaciones evolutivas entre las cepas circulantes (5-8). Se ha demostrado que el gen de la H es la región del genoma viral que presenta mayor variabilidad (6), sin embargo poco se sabe a cerca de la variabilidad genética del gen de la F. La proteína de Fusión contiene 662 aminoácidos y se divide en 3 regiones, el pre-péptido (residuos 1-135), F2 (residuos 136-224) y F1 (residuos 225-662). El objetivo de este trabajo fue evaluar en cepas locales, la variabilidad genética de la secuencia completa del gen de la proteína de Fusión, con respecto a cepas vacunales y a cepas internacionales de VDC. La diversidad genética en los genes codificantes para las proteínas de la envoltura viral, la Hemaglutinina (H) y la proteína de Fusión (F), estaría relacionada con el incremento en la incidencia del VDC y permite establecer relaciones evolutivas entre las cepas circulantes (5-8). Se ha demostrado que el gen de la H es la región del genoma viral que presenta mayor variabilidad (6), sin embargo poco se sabe a cerca de la variabilidad genética del gen de la F. La proteína de Fusión contiene 662 aminoácidos y se divide en 3 regiones, el pre-péptido (residuos 1-135), F2 (residuos 136-224) y F1 (residuos 225-662). El objetivo de este trabajo fue evaluar en cepas locales, la variabilidad genética de la secuencia completa del gen de la proteína de Fusión, con respecto a cepas vacunales y a cepas internacionales de VDC. MATERIALES Y METODOS: Se amplificó por RT-PCR el gen completo de la F a partir del ARN extraído de 14 muestras de sangre de animales con sintomatología compatible con VDC, en las que previamente se había detectado la presencia viral mediante la amplificación de un fragmento de 287 pares de bases (pb) correspondientes al gen de la nucleoproteína (NP). A tal efecto se utilizaron 6 pares de primers específicos que abarcan la totalidad del gen de la F. Los fragmentos amplificados fueron clonados en el vector pGEMT-easy (Promega) y secuenciados. Las secuencias fueron editadas usando el programa EditSeq DNAStar y alineadas con el programa Clustal W. Los porcentajes de identidad entre las cepas locales e internacionales reportadas en el GeneBank (incluyendo las secuencias de las cepas vacunales) se obtuvieron utilizando el programa Megalign DNAstar. Se amplificó por RT-PCR el gen completo de la F a partir del ARN extraído de 14 muestras de sangre de animales con sintomatología compatible con VDC, en las que previamente se había detectado la presencia viral mediante la amplificación de un fragmento de 287 pares de bases (pb) correspondientes al gen de la nucleoproteína (NP). A tal efecto se utilizaron 6 pares de primers específicos que abarcan la totalidad del gen de la F. Los fragmentos amplificados fueron clonados en el vector pGEMT-easy (Promega) y secuenciados. Las secuencias fueron editadas usando el programa EditSeq DNAStar y alineadas con el programa Clustal W. Los porcentajes de identidad entre las cepas locales e internacionales reportadas en el GeneBank (incluyendo las secuencias de las cepas vacunales) se obtuvieron utilizando el programa Megalign DNAstar. RESULTADOS: La comparación de las secuencias aminoacídicas de las cepas argentinas mostraron entre un 89 - 90,6 % de identidad con respecto a la cepa vacunal Onderstepoort (OP). Similares porcentajes de identidad, se obtuvieron cuando se compararon las secuencias de cepas salvajes de otras regiones del mundo, como Taiwán, China y USA, con respecto a la cepa vacunal. Por otro lado, el porcentaje de identidad entre las cepas argentinas fue de un 99%. La mayor cantidad de cambios (46 cambios) estuvieron presentes en la región correspondiente al pre-péptido, seguido por la región F1, con 15 cambios y por último la región F2 con sólo 2 cambios de aminoácidos. El alineamiento también reveló que además de los 5 sitios de N-glicosilación (N-X-S/T) presentes en la cepa vacunal OP, existe un sitio potencial, adicional de glicosilación entre los residuos 3 y 5 (N-K-T) en todos las cepas locales. Por otro lado, el análisis filogenético reveló que todas las cepas argentinas analizadas pertenecen al mismo clado, el cual se encuentra filogenéticamente distante al clado de la cepa vacunal. Esta situación es similar a lo observado entre los clados de las cepas internacionales (asiáticas, norteamericanas y europeas) y la cepa OP. La comparación de las secuencias aminoacídicas de las cepas argentinas mostraron entre un 89 - 90,6 % de identidad con respecto a la cepa vacunal Onderstepoort (OP). Similares porcentajes de identidad, se obtuvieron cuando se compararon las secuencias de cepas salvajes de otras regiones del mundo, como Taiwán, China y USA, con respecto a la cepa vacunal. Por otro lado, el porcentaje de identidad entre las cepas argentinas fue de un 99%. La mayor cantidad de cambios (46 cambios) estuvieron presentes en la región correspondiente al pre-péptido, seguido por la región F1, con 15 cambios y por último la región F2 con sólo 2 cambios de aminoácidos. El alineamiento también reveló que además de los 5 sitios de N-glicosilación (N-X-S/T) presentes en la cepa vacunal OP, existe un sitio potencial, adicional de glicosilación entre los residuos 3 y 5 (N-K-T) en todos las cepas locales. Por otro lado, el análisis filogenético reveló que todas las cepas argentinas analizadas pertenecen al mismo clado, el cual se encuentra filogenéticamente distante al clado de la cepa vacunal. Esta situación es similar a lo observado entre los clados de las cepas internacionales (asiáticas, norteamericanas y europeas) y la cepa OP. DISCUSION: Este trabajo muestra los resultados del análisis de secuencias completas del gen de la proteína de Fusión del VDC de cepas locales. Las comparación de las secuencias aminoacídicas mostró un 90% de identidad entre la cepa vacunal Onderstepoort y las cepas argentinas. Esta variabilidad del 10%, junto con las diferencias génicas reportadas para el gen de la hemaglutinina (3 - 8), estaría relacionada con la falta de reconocimiento por parte de los anticuerpos vacunales al enfrentarse con cepas salvajes y consecuentemente con el aumento en los casos de VDC a nivel mundial. Se pudo identificar un sitio adicional de glicosilación en todas las cepas argentinas además de los 5 sitios de N-glicosilación presentes en la cepa vacunal. Este sitio adicional podría alterar la estructura de la proteína con la consecuente modulación de la antigenicidad o virulencia (4). Cabe destacar que todas las cepas argentinas se agruparon en un único clado separado filogenéticamente de los clados que agrupan a las cepas internacionales y a la cepa vacunal. Este trabajo muestra los resultados del análisis de secuencias completas del gen de la proteína de Fusión del VDC de cepas locales. Las comparación de las secuencias aminoacídicas mostró un 90% de identidad entre la cepa vacunal Onderstepoort y las cepas argentinas. Esta variabilidad del 10%, junto con las diferencias génicas reportadas para el gen de la hemaglutinina (3 - 8), estaría relacionada con la falta de reconocimiento por parte de los anticuerpos vacunales al enfrentarse con cepas salvajes y consecuentemente con el aumento en los casos de VDC a nivel mundial. Se pudo identificar un sitio adicional de glicosilación en todas las cepas argentinas además de los 5 sitios de N-glicosilación presentes en la cepa vacunal. Este sitio adicional podría alterar la estructura de la proteína con la consecuente modulación de la antigenicidad o virulencia (4). Cabe destacar que todas las cepas argentinas se agruparon en un único clado separado filogenéticamente de los clados que agrupan a las cepas internacionales y a la cepa vacunal. CONCLUSIONES: Se analizaron por primera vez en Argentina las secuencias completas del gen de la F provenientes de 14 cepas locales de VDC, permitiendo su diferenciación con las cepas vacunales. Los resultados obtenidos mostraron que las cepas locales tienen un comportamiento similar a las cepas internacionales con respecto a la cepa vacunal. Estos resultados están orientados al desarrollo de inmunógenos actualizados de nueva generación que eventualmente proveerán una mayor capacidad protectiva que la vacuna de uso actual. Se analizaron por primera vez en Argentina las secuencias completas del gen de la F provenientes de 14 cepas locales de VDC, permitiendo su diferenciación con las cepas vacunales. Los resultados obtenidos mostraron que las cepas locales tienen un comportamiento similar a las cepas internacionales con respecto a la cepa vacunal. Estos resultados están orientados al desarrollo de inmunógenos actualizados de nueva generación que eventualmente proveerán una mayor capacidad protectiva que la vacuna de uso actual.