Caracterización bioquímica y molecular de bacterias solubilizadoras de fosfato y evaluación de su eficiencia en la promoción del crecimiento de Lotus tenuis

CASTAGNO LN; ESTRELLA MJ; GRASSANO A; RUIZ OA

Chascomús, Buenos Aires, Argentina

Taller; IV Taller Interdisciplinario de Lotus: Aspectos genéticos, moleculares y ecofisiológicos de Lotus spp. y sus simbiontes; 2008

Las comunidades halófitas de los bajos salino-alcalinos representan una proporción variable de los establecimientos de cría, llegando en ocasiones a superar el 30 % de su superficie. Por ello resulta evidente la necesidad de mejorar la capacidad de producción de estos ambientes a través de la incorporación (adaptación y distribución) de especies leguminosas como el género Lotus, por su condición de fijar  nitrógeno y su alto valor nutritivo para el rumiante (Quinos P.M. et al; 1998)La mejora de la fertilidad de los suelos es una de las estrategias más comunes para incrementar la producción agrícola. Mantener altos niveles disponibles de Nitrógeno (N) y Fósforo (P), los dos nutrientes más limitantes en suelos, continúa siendo un desafío.La mayoría de las investigaciones sobre biofertilizantes se han concentrado en el entendimiento y mejora de la fijación de N2. Sin embargo es sabido que cada aspecto del proceso de formación del nódulo es limitado por la disponibilidad de fósforo. Leguminosas tales como alfalfa y trébol han demostrado una respuesta positiva a la suplementación de fósforo (Gyaneshwar P. et al; 2002).Muchos microorganismos del suelo son capaces de solubilizar este fósforo no disponible a través de sus actividades metabólicas, mediante el exudado de ácidos orgánicos los cuales directamente disuelven la roca fosfática o quelan los iones calcio para liberar el fósforo a la solución. La producción de metabolitos microbianos resulta en un descenso en el pH del suelo, lo cual probablemente cumple un rol importante en la solubilización. (Abd-Alla M. H.; 1994).El descubrimiento de la relación mutualista entre plantas y bacterias solubilizadoras de fosfato (BSF), en la cual las bacterias proporcionan el fosfato soluble y las plantas aportan compuestos carbonados (principalmente azúcares), que promueven el crecimiento bacteriano, ha incrementado el interés en  el desarrollo de nuevas tecnologías, tales como el uso de BSF para la mejora de los cultivos a través de la biofertilización (Pérez E. et al; 2007) (Goldstein A.H.; 1995). Nuestra hipótesis de trabajo propone que la aplicación de bacterias solubilizadoras de fosfato en suelos salino-alcalinos incrementaría el nivel de fósforo disponible, contribuyendo de esta manera a mejorar sustancialmente la implantación y el desarrollo de Lotus tenuis en la región.Para comprobar esta hipótesis las actividades realizadas fueron las siguientes: Aislamiento y caracterización de bacterias solubilizadoras de fosfatoEn primera instancia se realizó la selección de BSF a partir de muestras de suelo de la rizósfera de Lotus tenuis obtenidas del campo perteneciente al Instituto Tecnológico de Chascomús y de la Estación Experimental de Manantiales. Se utilizó para tal fin un medio de crecimiento que permite la identificación de BSF por la aparición de un halo de solubilización en el medio de cultivo (Nautiyal C. S. et al; 1999). Determinación de la concentración de fosfato solubilizado:La concentración de fosfato solubilizado fue determinada a distintos tiempos (0, 24, 48 y 72 h.), permitiendo observar la cinética de solubilización de los diferentes aislamientos (Fiske C.H. & Subbarow Y.; 1925). Del mismo modo, en cada uno de estos tiempos se determinó el pH del medio para tratar de establecer una relación entre este parámetro y el fósforo soluble.En base a los resultados obtenidos y teniendo en cuenta la actividad de solubilización, los aislamientos  fueron clasificados en 3 grupos:      ActividadBaja    Intermedia    AltaAislamientos    I26, I29, I35, I38, M22, M52    I17, M51, M56, M87    M25, M75, M76, M77, M78, M89, M91 Diversidad genética e identificación taxonómica molecular de las bacterias solubilizadoras de fosfatoSe utilizó la técnica BOX-PCR y el cebador BOX A1R (5’- CTA CGG CAA GGC GAC GCT GAC G- 3’) para evaluar la diversidad genética de los aislamientos a efectos de identificar cepas con perfiles BOX diferentes y desestimar los que resultaran redundantes (Versalovic J. et al; 1991). Luego se procedió a la identificación taxonómica de las cepas con perfiles box no redundantes, mediante la amplificación y posterior secuenciación del gen que codifica para el ARNr 16s (Herrera-Cervera J.A. et al; 1999). Evaluación in vitro de la actividad PGPRLa BSF M91, uno de los aislamientos que mostró mayor actividad de solubilización de fosfato, fue seleccionada para inocular plántulas de Lotus tenuis cultivadas en medio Evans semisólido (Evans C.G.T. et al; 1970). Para simular las condiciones de estrés de los suelos se reemplazó la fuente de fosfato por Ca3(PO4)2 y se varió la relación P/N, así como el pH del medio.Las variables analizadas fueron peso seco de parte aérea y contenido de fósforo total en planta (Murphy and Riley; 1962).Los datos obtenidos fueron analizados por ANOVA de dos vías (P: 0.05) §         Ensayo 1: Inoculación con M91 a pH 7 variando la relación P/N del medio de cultivo.ü      Al comparar con el control no inoculado se observa que la inoculación con la BSF M91 promovió significativamente el crecimiento de Lotus tenuis.ü      El crecimiento de las plantas inoculadas con la BSF M91 se vio aumentado por altos niveles de N (10 ppm N) en el medio de cultivo.ü      El contenido de P (mg P g-1 Peso seco) fue similar para todos los tratamientos.§         Ensayo 2: Inoculación con M91 a pH 7, 8 y 9. (10 ppm N)ü      La actividad PGPR de la BSF M91 no se vio afectada por un cambio de pH de 7 a 8.ü       Por el contrario, un cambio posterior en el pH de 8 a 9 redujo significativamente la actividad PGPR de este aislamiento.§         Ensayo 3: Inoculación con M91 a pH 8 variando la relación P/N del medio de cultivo.ü      Al igual que a pH 7, el crecimiento de plantas inoculadas con BSF M91 se vio incrementado a altos niveles de N cuando el pH del medio de cultivo fue ajustado a 8.