Expresión recombinante de GAD65 en larvas de insecto. Aplicación en el diagnóstico de Diabetes Autoinmune y en pruebas de tolerancia en ratones NOD

TRABUCCHI, A; MARFÍA, JI; BOMBICINO, SS; FUERTES, F; SABLJIC, AV; PERONE, MJ; MIRANDA, MV; VALDEZ, SN

Congreso; XXI Congreso Argentino de Diabetes; 2018

Introducción. La isoforma de 65kDa de la glutamato decarboxilasa (GAD65) es uno de los principales autoantígenos en Diabetes Mellitus Autoinmune (DMA) reconocido por los autoanticuerpos GADA, marcadores altamente predictivos de la patología.Objetivo. Expresar GAD65 en el sistema baculovirus-larvas de insecto, para ser utilizada en el desarrollo de kits diagnósticos, y en ensayos de inducción de tolerancia en ratones NOD.Materiales y Métodos. Se infectaron larvas Rachiplusia nu y Spodoptera frugiperda con baculovirus recombinantes conteniendo el gen codificante para GAD65 fusionada a His6. Luego de 4 días GAD65 fue recuperada mediante protocolos de lisis y purificada por cromatografía de afinidad. Se corroboró su identidad por SDS-PAGE y Western blot (WB) y se determinó su actividad enzimática. La caracterización inmunoquímica se realizó mediante ensayos radiométricos utilizando sueros de pacientes diabéticos GADA+ en presencia de 35S-GAD65. Empleando, GAD65 de S.frugiperda se desarrolló un inmunoensayo (b-ELISA) basado en la doble interacción de GADA, con GAD65 inmovilizada a la placa y con el antígeno soluble marcado con biotina. Se evaluaron 44 sueros de pacientes diabéticos GADA+ y 56 sueros humanos normales. Se comparó la performance del diseño frente al método de referencia (RBA). Además, se determinó la proliferación de esplenocitos obtenidos de ratones NOD luego de un estímulo con GAD65 de S.frugiperda.Resultados. La expresión de GAD65 se corroboró mediante SDS-PAGE y WB a través de la presencia de una banda de 65kDa. Los niveles de expresión fueron 1,06mg/g R.nu 95% pura y 5,7mg/g S.frugiperda 97% pura, ambas con actividad enzimática. Los ensayos inmunoquímicos mostraron que GAD65 de R.nu y S.frugiperda inhibieron la unión de 35S-GAD65 a los GADA de 25,5% a 4,78% y 4,58%, respectivamente. Las curvas dosis-respuesta demostraron inmunorreactividad de GAD65, siendo la concentración que causó el 50% de inhibición de 1,07x10-7M a 7,21x10-9M. El b-ELISA evidenció tener una sensibilidad analítica de 77,3% y 98,2% de especificidad, con un rango dinámico mayor al del RBA. Los ensayos de estimulación in vitro con GAD65 en esplenocitos de ratón NOD mostraron un incremento de la proliferación celular de 90 veces respecto del basal.Conclusiones. Se logró expresar eficientemente GAD65 recombinante humana en larvas de insecto. La proteína presentó actividad enzimática y fue inmunorreactiva frente a sueros de pacientes diabéticos. La producción de GAD65 empleando S.frugiperda factibiliza el desarrollo de inmunoensayos para la detección de GADA, útiles en el diagnóstico de DMA, y su empleo en ensayos preliminares de inducción de tolerancia como estrategia terapéutica.