Caracterizacion del efecto del insulador de cromatina de la arilsulfatasa (ARSI) de erizo de mar en vectores gamaretrovirales autoinactivados (SIN)

PENA, M; RODRIGUEZ, TM; CARREA, A; PERONE, MJ; DEWEY, RA

Congreso; LVII Reunión Anual de la Sociedad Argentina de Investigación Clínica y LX Reunión Científica Anual de la Sociedad Argentina de Inmunología; 2012

Los gamaretrovirus son ampliamente utilizados en terapia génica por su capacidad de integrarse al genoma de la célula huésped, generando una expresión estable del transgen terapéutico. Sin embargo una vez integrado puede producir mutagénesis insercional, o la expresión puede silenciarse. Por este motivo se están investigando insuladores de cromatina, uno de ellos es el de la arilsulfatasa de erizo de mar (ArsI). En este trabajo estudiamos el efecto de ArsI sobre el silenciamiento génico en vectores gamaretrovirales SIN. Para ello clonamos ArsI en orientación sentido (R-EFS-W/A+) o antisentido (R-EFS-W/A-) en la región U3 del LTR3´ del vector parental bicistrónico pSRS11.EFS.WASP.ireseGFP.pre (R-EFS-W). Se detectó la presencia de ArsI en el LTR5´ del provirus mediante PCR de células HT1080 transducidas con los vectores recombinantes. Además, se determinó por FACS que la inclusión del insulador no va en detrimento del título viral. Para evaluar el efecto de ArsI sobre el silenciamiento transgénico, se transdujeron células HT1080 a MOI10 que fueron purificadas utilizando un cell sorter hasta obtener una pureza de 80%. El porcentaje de células expresando GFP y la proteína WASP fue monitoreado por FACS y western blot respectivamente, a intervalos de 15 días durante 14 semanas. Así observamos que en el vector R-EFS-W/A+, la expresión génica disminuye dramáticamente a los pocos días de cultivo, mientras que, tanto el vector R-EFS-W/A- como R-EFS-W mantienen los niveles de expresión transgénica. Por lo tanto, nuestros resultados indican que en vectores gamaretrovirales SIN la orientación sentido del ArsI acelera el silenciamiento génico. Además, comprobamos que con ArsI en orientación antisentido los niveles de expresión son similares a los obtenidos con el vector parental, y que a diferencia de otros vectores retrovirales no hay una rápida disminución de la expresión génica. Esta información inicial contribuye para el desarrollo de vectores virales más seguro y efectivos.