MALDI MS EN EL DISEÑO DE LIGANDOS CON AFINIDAD POR HORMONA DE CRECIMIENTO Y UN ANTICUERPO MONOCLONAL TERAPÉUTICO

SOLEDAD L. SAAVEDRA; GABRIELA R. BARREDO; SILVANA L. GIUDICESSI; MARÍA C. MARTÍNEZ-CERÓN; OSVALDO CASCONE; FERNANDO ALBERICIO; SILVIA A. CAMPERI

Congreso; III Congreso Argentino de Espectometría de Masas (III CAEM); 2016

SAEM

La cromatografía de afinidad se basa en la interacción selectiva entre unamolécula de interés y un ligando inmovilizado sobre una matriz cromatográfica. Por su alta selectividad y afinidad, es la metodología de elección para la purificación de proteínas recombinantes a partir de un caldo de cultivo celular. A diferencia de los ligandos proteicos, los péptidos cortos son fáciles de sintetizar, son estables y de bajo costo.La construcción de bibliotecas combinatorias peptídicas permite la selección deligandos con afinidad adecuada para cualquier proteína de interés. El objetivo del presente trabajo fue buscar péptidos con afinidad por la hormona de crecimiento humana recombinante (rhGH) y un anticuerpo monoclonal (mAb) terapéutico con el fin de usarlos como ligandos de afinidad.Se construyeron bibliotecas combinatorias peptídicas en fase sólida por el método dividir-acoplar-recombinar, que consiste en dividir el soporte sólido en un número de porciones iguales, tantas veces como bloques de construcción (aminoácidos) se vayan a usar, acoplar a cada porción un aminoácido diferente y, luego, mezclar las porciones y volverlas a dividir para el siguiente acople. Esto asegura que todos los aminoácidos estén presentes en igual proporción y que cada bolilla de resina tenga una única entidad peptídica.Para hallar péptidos con afinidad por los biofármacos, estos se marcaron conbiotina o con Texas red. Se puso en contacto el biofármaco con las bibliotecas en condiciones astringentes y, luego de sucesivos lavados, se seleccionaron las bolillas que resultaron marcadas por la adsorción del complejo biofármaco-etiqueta. Luego del lavado de las bolillas, los péptidos de cada bolilla aislada se identificaron por espectrometría de masas MALDI-TOF MSMS.Se obtuvieron numerosas bolillas positivas para ser identificadas por MS. Paraevitar la selección de bolillas falsas positivas, a las bolillas aisladas que adsorbieron el biofármaco marcado con Texas red, se las lavó y luego se las incubó con el biofármaco marcado con biotina. Luego, las bolillas fueron reveladas con estreptavidina peroxidasa y α-cloronaftol. Aquellas que dieron doblemente positivas, fueron aisladas y secuenciadas por MALDI-TOF MSMS. En total, se obtuvieron las secuencias de 44 péptidos para la rhGH y 80 para el mAb terapéutico. En lo sucesivo, se evaluarán dichos péptidos como ligandos de afinidad para la purificación de dichos biofármacos.