Caracterización funcional de CueP, el factor de homeostasis periplásmica de cobre de Salmonella entérica.

GIRI GF; FELS UA; CHECA, S. K.; SONCINI F C

Rosario

Congreso; XXIII Congreso Latinoamericano de Microbiología y XIV Congreso Argentino de Microbiología; 2016

Asociación Latinoamericana de Microbiología y Asociación Argentina de Microbiología

Dos regulones son esenciales en la mayoría de las enterobacterias para la resistencia a cobre. El regulón Cue, cuyo regulador transcripcional, CueR, activa la expresión de genes que codifican para una ATPasa tipo P que transporta el Cu(I) desde el citoplasma al periplasma, y para una multicobre oxidasa periplásmica que oxida el Cu(I) a Cu(II). Un segundo locus accesorio en el control de la homeostasis de cobre, denominado cus, codifica para un sistema de dos componentes y para una bomba de eflujo del tipo RND, CusCFBA, responsable de la resistencia a cobre fundamentalmente en anaerobiosis. Salmonella carece del locus cus, y además de los genes ancestrales del regulón Cue, contiene otro gencontrolado por CueR, cuyo producto de localización periplásmica, CueP, es esencial para la resistencia a cobre en anaerobiosis. La observación de que bacterias que expresan a homólogos de CueP no poseen el locus cus y viceversa nos ha permitido postular a CueP como el responsable de la homeostasis periplásmica de cobre en reemplazo de Cus. Decidimos por lo tanto comprobar si cus es capaz de compensar la ausencia de cueP en Salmonella, evaluando la tolerancia al metal en anaerobiosis y la sobrevida intracelular en macrófagos de una cepa de Salmonella mutante en cueP que expresa en su lugar el locus cus de E. coli. Para la construcción de la cepa mutante se emplearon dos etapas de PCR en un sólo paso amplificando el locus cus completo de E. coli y transfiriéndolo a una cepa de Salmonella que posee el sistema de recombinación red del fago lambda seleccionando por resistencia a antibiótico. Por transducción con el fago P22 se transfirieron dichas construcciones a la cepa de Salmonella 14028s. Para la determinación de la tolerancia a cobre se emplearon ensayos de CIM sembrando diluciones de las cepas estudiadas en placas con LB suplementadas con distintas concentraciones de metal. Con respecto al ensayo de sobrevida intracelular se infectaron macrófagos RAW 264.7 con las distintas cepas de Salmonella y se determinó la sobrevida de las mismas 18 hpi. Sorpresivamente hallamos quela cepa mutante en cueP que expresa el locus cus presenta mayor resistencia a cobre que la cepa silvestre, sugiriendo que la bomba de eflujo CusCFBA es más eficiente que CueP en esta función. Sin embargo, la sobrevida en macrófagos de la cepa conteniendo el locus cus en lugar de cueP se vio disminuida de la misma manera que una cepa mutante en cueP. En base a estos estudios concluimos que, en detrimento de una leve pérdida en la resistencia a cobre, Salmonella adquirió el gen que codifica la proteína periplásmica CueP en reemplazo del locus cus paragarantizar su sobrevida en macrófagos.