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Interferencia con ARN por alimentación en el ciliado Tetrahymena thermophila aplicada a la identificación de desaturasas de esteroles. Sebastián R. Najle1, Alejandro Nusblat2, Clara Nudel2 y Antonio D. Uttaro1 1 Departamento de Microbiología. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario (IBR-CONICET). Suipacha 531. S2002LRK, Rosario. Argentina. 2 Cátedra de Biotecnología y Microbiología Industrial, Facultad de Farmacia y Bioquímica, Universidad de Buenos Aires, Junín 956, 1113 Buenos Aires, Argentina. Los ciliados del género Tetrahymena son protozoos de vida libre que habitan suelos, arroyos, lagunas y estanques. Son células grandes, de 40 a 50 mm a lo largo de su eje antero-posterior, con unas 1000 cilias ordenadas principalmente en filas longitudinales. La organización genómica de los ciliados es inusual ya que presentan dualismo nuclear. Estos microorganismos constituyen un excelente sistema biológico para el estudio de varios aspectos de la bioquímica de membranas. Las membranas de T. thermophila contienen un único alcohol triterpenoide pentacíclico, el tetrahymanol, que el microorganismo es capaz de sintetizar mediante la ciclación del escualeno producido a través de la vía del ácido mevalónico. El tetrahymanol se localiza principalmente en las membranas limitantes del organismo y su función parece ser similar a la de los esteroles en las membranas de organismos superiores. A pesar de no poseer esteroles sintetizados endógenamente, Tetrahymena tiene la capacidad de incorporar esteroles existentes en el medio y modificarlos produciendo pro-vitaminas D. En el caso de los esteroles de la serie colestan, los mismos son convertidos principalmente en 7, 22-bis dehidrocolesterol mediante una serie de desaturaciones en las posiciones C5(6), C7(8) y C22(23). Esta capacidad de biotransformación de esteroles tiene un claro interés biotecnológico ya que el 7-dehidrocolesterol es la provitamina D3, y la eventual aplicación de esta actividad enzimática en la constitución de alimentos funcionales de origen animal tendría el doble efecto de la reducción del contenido de colesterol con el concomitante enriquecimiento en provitamina D3. A pesar del gran desarrollo de herramientas genéticas y de biología molecular utilizables en T. thermophila existe una serie de restricciones prácticas para su aplicación: 1) el genoma de este organismo es muy rico en A+T lo que torna muy trabajosa su amplificación por PCR; 2) los codones UAA y UAG, que son codones de terminación en otros organismos, codifican aquí Glutamina (Q) dificultando la expresión heteróloga de genes; 3) las células deben encontrarse en conjugación para ser competentes para la electroporación. Las células vegetativas pueden transformarse por bombardeo biolístico o, con mucha menor eficiencia, por microinyección directa del macronúcleo. Debido a estas dificultades se decidió poner a prueba la técnica de interferencia con ARN por alimentación con bacterias que sobre-expresan ARNs de doble hebra. Esta técnica fue desarrollada para el nemátodo Caenorhabditis elegans, y posteriormente fue aplicada con éxito en otros organismos incluyendo nemátodos parásitos e incluso ciliados de otros géneros, pero nunca antes fue empleada sobre Tetrahymena. El empleo de esta sencilla técnica de genética reversa permitió identificar una oxidasa con dominio Rieske que estaría involucrada en la conversión de esteroles en derivados D7 insaturados, convirtiendo el colesterol en provitamina D3.

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