INVESTIGADORES
NUSBLAT Alejandro David
congresos y reuniones científicas
Título:
EXPRESIÓN DE C7 ESTEROL DESATURASA DE TETRAHYMENA THERMOPHILA EN CÉLULAS DE INSECTO
Autor/es:
POKLEPOVICH T.J; URTASUN, N; MIRANDA, V; A. D. NUSBLAT; B.C. NUDEL
Lugar:
Buenos Aires
Reunión:
Congreso; XIII Congreso Argentino de Microbiología; 2013
Institución organizadora:
Asociacion Argentina de Microbiologia
Resumen:
EXPRESIÓN DE C7 ESTEROL DESATURASA DE TETRAHYMENA THERMOPHILA EN CÉLULAS DE INSECTO Poklepovich, T; Urtasun, N; Miranda, V; NusblatNusblat], A; Nudel, C La asociación entre la ingesta de colesterol y las enfermedades cardiovasculares es indiscutida, por lo que es deseable disponer de una estrategia viable que elimine el colesterol de los alimentos. La transformación de colesterol en provitamina D3 es una alternativa novedosa en la producción de alimentos más saludables, ya que permite disminuir el colesterol de los alimentos de origen animal, transformándolo en un nutriente esencial. Por otro lado, actualmente, la producción de provitamina D3 se hace través de procesos de síntesis orgánica, que involucran numerosos pasos y compuestos perjudiciales para el medioambiente. Proponer un sistema biológico para sintetizar provitamina D3 a partir de colesterol, implicaría una mejora en la producción sin dañar el medioambiente. La biotransformación de colesterol en provitamina D3 consiste en la introducción de un doble enlace en la posición 7(8) del anillo B. Recientemente se encontró el gen que codifica para la enzima responsable de dicha biotransformación en el ciliado Tetrahymena thermophila. El análisis de la proteína, arrojó la presencia de un dominio Rieske, uno de unión a hierro no hemínico y una región transmembrana en la región N-terminal, con lo cual esta proteína se agrupa dentro de las Oxigenasas Rieske tipo 1A, presentando una alta similitud con las esterol C7-desaturasas de Drosophila y C. elegans. Con vistas a futuro de expresar esta enzima en sistemas más complejos, como células de mamíferos o de aves, se decidió expresarla en células de insecto ya que es un sistema eficiente para sobreexpresar proteínas, además de presentar alta similitud entre las secuencias del grupo oxigenasas Rieske de T.thermophila y las de insectos. En el presente trabajo se busca sobreexpresar la proteína en una línea celular del insecto Spodoptera frugiperda (Sf9). Dado que T. thermophila posee un uso de codones diferente, se tradujo la secuencia, optimizándola para la expresión en Sf9, se sintetizaron los genes codificanetes agregando además una cola de histidinas para su detección y purificación. La expresión se efectuó empleando el sistema de baculovirus, el análisis de la producción del virus recombinante se efectuó por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con primers específicos para el gen y la expresión de la proteína en las células Sf9 se analizó por Western blot con anticuerpos anti-cola de histidinas en diferentes fracciones subcelulares provenientes de una centrifugación diferencial, analizando el homogenato inicial, la fracción nuclear, mitocondrial y la fracción microsomal. Se obtuvieron los baculovirus recombinantes y luego se logró expresar mediante la infección con baculovirus la proteína recombinante C7-desaturasa. El método de baculovirus fue el adecuado para la expresión de la enzima en las células Sf9. Por otro lado la proteína fue observada en la fracción microsomal, hecho que está de acuerdo con lo esperado dado que es una enzima de localización en retículo endoplásmatico.
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