La acetilación de lisinas modula la actividad catalítica y el posicionamiento de PKA

GENTILE, IÑAKI; NOVERO, ANALIA G.; CURCIO, CATALINA; MATAMOROS VOLANTE, ARTURO; BIGLIONE, FRANCO A; STEEMAN, TOMÁS J; BINOLFI, ANDRES; ROSANO, GERMAN L; BUFFONE, MARIANO G.; KRAPF, DIEGO; STIVAL, CINTIA; KRAPF, DARIO

Congreso; XXVI Reunión Anual de la Sociedad Argentina de Biología (SAB); 2024

Los espermatozoides de mamíferos requieren un período de residencia en el tracto reproductivo femenino para adquirir capacidad fecundante, en un proceso denominado "capacitación". Este proceso puede lograrse in vitro al incubar los espermatozoides en un medio definido que induce la activación de la Proteína Quinasa A (PKA), un actor clave en la capacitación espermática. El paradigma clásico, indica que PKA se activa por unión directa de AMPc a sus subunidades regulatorias lo cual provoca la liberación de las subunidades catalíticas (PKAc). Sin embargo, recientemente se ha demostrado que los niveles de AMPc disminuyen después de 10 min de incubación en medio capacitante, mientras que la actividad enzimática de PKA permanece constante, sugiriendo que existen otros mecanismos que modulan su actividad. En este sentido, un estudio previo identificó a PKAc acetilada en la Lys279 en espermatozoides humanos capacitados. Adicionalmente nuestro grupo ha encontrado que la inducción farmacológica de acetilación, aun en condiciones donde no aumenta el AMPc, produce la fosforilación de sustratos de PKA, de la misma forma que en condiciones capacitantes por aumento de AMPc. Estos resultados sugieren que la acetilación en Lys de PKAc podría constituir un mecanismo alternativo de su regulación. Con el objetivo de estudiar los efectos de la acetilación sobre la subunidad catalítica de PKA, se purificó una versión recombinante de PKAcalpha1 de ratón (“rPKAc”) y se la sometió a acetilación in vitro utilizando extractos de espermatozoides suplementados con AcetilCoA e inhibidores de deacetilasas. Nuestros resultados de espectrometría de masas indican que rPKAc puede ser acetilada por acetiltransferasas espermáticas en Lys168, Lys279 y Lys309. Ensayos de actividad quinasa revelaron que rPKAc acetilada exhibe una mayor actividad catalítica en comparación con su contraparte no acetilada, aunque este incremento no ocurre mediante aumento en la fosforilación de Thr197, un marcador tradicional del estado de activación de PKA. Experimentos de resonancia magnética nuclear, permitieron detectar cambios conformacionales inducidos por acetilación en regiones claves para la unión de ATP y la catálisis, sustentados por estudios cinéticos mostrando una disminución significativa de Km para ATP en la forma acetilada indicando una mayor afinidad por el ATP, lo que resulta en un incremento de su actividad catalítica. Finalmente, mediante microscopía de superresolución en espermatozoides murinos, observamos que la inducción de la acetilación induce la disociación de las subunidades catalíticas y regulatorias de PKA y su relocalización dentro de la célula, imitando los patrones observados durante la capacitación. En conjunto, nuestros hallazgos sugieren que la acetilación de lisinas regula a PKA en espermatozoides a través de múltiples mecanismos.