Comportamiento reológico y fidelidad de impresión 3D de mezcla de gelatina

BERTUOLA. M; PALMA J.; HERMIDA E.

CABA

Jornada; XIV Jornada de Farmacia y Bioquímica Industrial (JorFyBI 2019); 2019

Asociación Argentina de Farmacia y Bioquímica Industrial. SAFYBI

Los recientes avances en bioingeniería y regeneración de tejidos han proporcionado evidencias de que la medicina regenerativa promete mejorar drásticamente el enfoque del trasplante tradicional de órganos. Entre las metodologías empleadas para regenerar, reparar o reemplazar tejidos dañados o enfermos, la bioimpresión 3D surge como una herramienta flexible con gran potencial en una variedad de aplicaciones de ingeniería de tejidos y medicina regenerativa.En particular, la regeneración de piel mediante membranas de regeneración convencionales presenta como desventaja la geometría pre-establecida que puede no ajustarse a la topología de la región donde se debe implantar. La interrupción de la continuidad del tejido dérmico puede deberse a quemaduras, las cuales ocasionan 180.000 muertes al año (OMS), a la presencia de úlceras abiertas, representando un 0,1 a 0,3% de la población mundial, y a úlceras de pie presente en pacientes diabéticos con una incidencia anual de 4-8% en países en desarrollo. El uso de hidrogeles como tintas es altamente promisorio para la impresión 3D de matrices bioactivas. En efecto, estas redes poliméricas con alto contenido de agua presentan ventajas como fácil procesamiento y curado, buena biocompatibilidad, posibilidad de formulación de biotintas (tintas que contienen células vivas), biodegradabilidad, etc. Sin embargo, suelen degradarse en pocas horas en medio de cultivo, lo cual dificulta su aplicación (Pan et al., 2016). En este trabajo se analizarán las propiedades reológicas y de fidelidad de impresión de una tinta a base de alginato y gelatina. También se evaluará el efecto del reticulado por iones Ca+2 sobre la estabilidad y propiedades de hinchamiento en condiciones de cultivos in vitro.Materiales y MétodosPara formular la tinta se empleó una combinación de gelatina (250 Bloom) y alginato de grado alimenticio. Las medidas reológicas se llevaron a cabo en un reómetro Discovery HR-3 (TA Instruments, EE.UU.) utilizando una geometría plato-cono (ángulo de cono: 2º, diámetro: 40mm, gap: 60µm) y una trampa de solvente para evitar la deshidratación del hidrogel. Se realizaron ensayos rotatorios y oscilatorios aplicando el protocolo SAOS (small amplitude oscillatory shear). El rango viscoelástico lineal de la tinta se determinó mediante un barrido de amplitud de deformación (), confirmando un comportamiento lineal hasta 1,3%. Adicionalmente se llevaron a cabo barridos de temperatura en modo oscilatorio con el propósito de precisar la temperatura de gelación (Tgel) y barridos de tiempo a temperatura ambiente para determinar el tiempo de gelación (tgel) del hidrogel.Para analizar la fidelidad de impresión (Pr) de la tinta se generaron grillas rectangulares con poros de 2mm de lado mediante el software slic3r, calculando el parámetro Pr según:Pr= L^2/16Adonde L y A corresponden a la longitud lateral interna y al área del poro, respectivamente. Cuanto más cercano a 1 es el factor Pr, mejor será la fidelidad de impresión. Las geometrías impresas se entrecruzaron mediante inmersión en una solución 0,9M de CaCl2 a distintos tiempos, para luego evaluar las propiedades de hinchamiento. El grado de hinchamiento (G.H.%) influye tanto en el transporte de nutrientes dentro del andamio como en sus propiedades mecánicas. Con el fin de evaluar esta cualidad, los andamios se incubaron en un buffer fosfato (PBS) a 37ºC durante 72 horas. G.H.% se calculó como la diferencia de peso entre el andamio sumergido un tiempo t (Wt) y el peso inicial (W0), es decir,G.H.(%)=(W_t-W_0)/W_0 ×100Resultados y discusiónLa figura 1A muestra la evolución de la viscosidad en función de la velocidad de deformación (γ ̇) aplicada a 37ºC. En el registro se observa un comportamiento pseudoplástico de la tinta evidenciándose una viscosidad que disminuye exponencialmente con γ ̇. Como la velocidad de deformación de corte brindada por la bioimpresora oscila entre 12 y 35 1/s, el esfuerzo de corte en la tinta está entre de 570-950Pa. Figura 1. A) Viscosidad en función de la velocidad de deformación a 37°C; B) G´ y G´´ vs temperatura, medido en enfriamiento a -1ºC/min para la tinta de gelatina y alginato. La figura 1B muestra una Tgel de la tinta de 25,1±0,3°C. Durante la impresión el cartucho con la tinta se lleva temperaturas mayores a la Tgel, de modo que la tinta presenta un comportamiento fluido que facilita la extrusión. Cuando el filamento se deposita en la platina a temperatura ambiente, se produce la gelación, necesaria para la calidad de impresión. La figura 2B presenta el cambio en el módulo dinámico cuando la tinta, inicialmente a 37ºC, evoluciona en el tiempo a 25ºC; se obtuvo un tiempo de gelación de 140±14s; este parámetro es importante, ya que nos da un orden de magnitud del tiempo de impresión de cada capa para que la adhesión entre ellas se vea favorecida. Adicionalmente, la tinta impresa a 37ºC a través de una boquilla de extrusión de 260µm presentó alta fidelidad de impresión: (0,96±0,02), similar a lo obtenido en la literatura (Kyle et al., 2017). Figura 2. A) G´ y G´´ de la tinta vs. tiempo a 25ºC. B) G.H.% vs. tiempo de inmersión en PBS a 37ºC para andamios con distinto tiempo de inmersión en la solución de iones Ca2+. La figura 2B, por su parte, muestra el grado de hinchamiento de impresos inmersos en PBS a 37ºC, previa inmersión en CaCl2, que es un agente reticulante de la red de alginato. A pesar de la gran incerteza del experimento, se puede apreciar que a tiempos cortos de entrecruzamiento, los andamios rápidamente alcanzan un 40% de hinchamiento; en cambio, se mantienen en la región de ±20% de hinchamiento, si previo al baño en PBS se los ha sumergido en CaCl2 por 10 o 20 minutos. Dicho efecto se atribuye a un mayor porcentaje de entrecruzamiento, por la difusión de iones Ca2+ desde las capas externas del andamio hacia su interior. Ese entrecruzamiento limita la expansión de la gelatina logrando preservar la morfología del andamio por 72 hs, lo cual supera ampliamente la respuesta de andamios similares reportados en bibliografía (Pan et al., 2016).