MccJ25: Estudio de su Inserción en Membranas Biológicas

PLOPER, DIEGO

San Miguel de Tucuman

Jornada; 4° Jornada los Jóvenes y la Ciencia; 2003

Consejo de Investigaciones - Secretaria de Ciencia y Técnica - Universidad Nacional deTucuman

Este trabajo propuso profundizar los estudios de la interacción de microcina J25 con membranas modelos, determinando el alcance de la inserción del péptido en la membrana y la influencia del espesor de la bicapa, mediante experimentos de "quenching" de la fluorescencia intrínseca de tirosina. Para ello era fundamental el uso de quencheadores residentes en la membrana como el 1-palmitoil-2-estearil-(5-doxilo)-sn-glicero-3-fosfatidilcolina (DPC) y otros con el grupo doxilo en distintas posiciones de las cadenas hidrofóbicas. Lamentablemente, debido a la situación económica, ha sido imposible la importación de estos reactivos. A la luz de esta situación, se propuso buscar métodos alternativos para resolver el problema planteado usando reactivos que estuvieran disponibles en el laboratorio. Se resolvió hacer experimentos de transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FRET). Para ello se necesitan fluoróforos con la propiedad de tener una buena absorbancia a la longitud de onda de emisión de fluorescencia intrínseca de MccJ25 (alrededor de 310 nm), y no absorber a la longitud de onda con la que se excita (270 a 280 nm). Además debía penetrar en las membranas modelos y en lo posible tener análogos que lo hicieran a distintas profundidades. La única sustancia que reunía estas características fue el 1,6-dipheny1-1,3,5-hexatriene (DPH) que se ubica en la región del core hidrofóbico de la membrana. A pesar de que su absorbancia a la longitud de onda de emisión de fluorescencia de microcina J25 no era la óptima y que mostraba pequeños picos de absorbancia entre 260 y 300 nm se decidió emplearlo de todos modos. 1) Búsqueda de la bibliografía concerniente al empleo de DPH en experimentos de FRET para calcular la distancia entre el emisor y el aceptor de fluorescencia. 2) Preparación de los liposomas. 3) Purificación de MccJ25 del sobrenadante. 4) Experimentos de FRET: Se realizaron empleando DPH para estudiar la inserción del péptido en los liposomas preparados. Los resultados mostraron una pequeña transferencia de energía de alrededor del 15%. Este porcentaje de transferencia no se considera significativo para sacar conclusiones definitivas acerca de la profundidad de la inserción del péptido. Aprovechando la existencia de una pequeña cantidad de TMA-DPH (1-(4- trimethylammoniumpheny1)-6-pheny1-1,3,5-hexatriene-p-toluenesulfonate), análogo al DPH pero con una ubicación en membranas modelos próxima a la región de las cabezas polares de los fosfolípidos, se realizaron experimentos paralelos empleando los dos reactivos a fin de detectar alguna diferencia en la transferencia de energía. Estos resultados mostraron que había menor transferencia con el TMA-DPH, pero nuevamente los porcentajes de transferencia obtenidos no permiten sacar conclusiones.