Efecto de la luz UV-C sobre la producción de metabolitos secundarios en cepas del género Alternaria

MENDEZ GALARRAGA, MARIA PAULA

Santa Fe

Encuentro; XVII Encuentro de Jóvenes Investigadores; 2013

Universidad Nacional del Litoral

El género Alternaria es uno de los principales géneros fúngicos contaminantes de alimentos y se encuentran ampliamente distribuidos en el ambiente. Presenta especies que son saprófitas o patógenas capaces de deteriorar productos alimenticios y piensos, y causar enfermedades con gran impacto económico (Thomma, 2003). Las especies de Alternaria son capaces de producir al menos 70 metabolitos secundarios y otros compuestos biológicamente activo siendo las más estudiadas: alternariol (AOH), alternariol metil éter (AME) y ácido tenuazónico (TA) por su potencial riesgo toxicológico. La exposición a las toxinas de Alternaria spp. se han relacionado con la aparición de efectos adversos para la salud en personas y animales y, en muchos casos, se ha demostrado que tienen capacidad genotóxica, mutagénica, carcinogénica y citotóxica (Pavon Moreno et al., 2012). La luz ultravioleta de onda corta (UV-C) es utilizada en las industrias por su gran poder germicida, para desinfectar superficies (EPA, 1999). La irradiación ultravioleta (UVGI) es un método conocido de inactivación de una amplia variedad de microorganismos. Se ha demostrado que las esporas fúngicas se encuentran entre las estructuras más resistentes a las radiaciones UV, especialmente las que poseen melanina en sus conidios y/o micelio pigmentados pudiendo causar efectos mutagénicos, alteraciones morfológicas y diferentes patrones de producción de micotoxinas (Abdel Hameed et al., 2012). Actualmente no existen reportes sobre los distintos patrones de micotoxinas generados por la luz UV-C sobre el género Alternaria. el objetivo del trabajo fue evaluar la capacidad de supervivencia y producción de metabolitos secundarios de especies de Alternaria, posterior a la irradiación de sus conidios con una lámpara UV-C y compararlas con su capacidad previa de síntesis de estos metabolitos. METODOLOGÍA Reactivación de cepas de Alternaria: Se reactivaron 17 cepas del género Alternaria, provistas por el Laboratorio de Química Orgánica, de la Facultas de Ciencias Exactas y Naturales, de la Universidad Nacional de Buenos Aires, por la Dra. Virginia Fernández Pinto. Se corroboró tanto la pureza de las colonias como así también la identidad de las especies de Alternaria teniendo en cuenta: los diferentes modelos de esporulación de los grupo-especie, caracteres microscópicos y macroscópicos según Emory G. Simmons (2007). Producción y recuento de propágulos fúngicos de las distintas cepas de Alternaria: Se preparó las suspensiones de los propágulos fúngicos partiendo de cultivos en fase de crecimiento exponencial tardía y fase de crecimiento exponencial estacionaria ajustando las concentraciones a 106-107 propágulos fúngicos/mL en tubos conteniendo 5 ml de Tween 20 (0,1% v/v en agua estéril). Se realizaron los recuentos en cámara de Neubauer y recuentos en placas de Petri con medio de cultivo V8 para corroborar dichas concentraciones. Estudio de la inactivación de propágulos fúngicos de Alternaria por acción de la radiación UV-C: Se sembró 1 mL de las suspensiones de los propágulos fúngicos de las especies de Alternarias en una superficie de acero inoxidable de 25 cm2 las mismas fueron sometidas a la acción de la luz UV-C (15 W) durante 40 minutos a 2 cm de distancia, con una longitud de onda de 254 nm y con una fluencia de 9600J m-2. El equipo fue previamente calibrado. Posterior a la irradiación los conidios fueron recolectados con hisopos conteniendo 1,3 mL de agua de peptona. Se realizaron diluciones seriadas y se sembró 1 mL en profundidad en placas de Petri en medio de cultivo V-8. Se incubó a 28ºC durante 5 días. Se realizaron recuentos en placa expresándolos en Unidades Formadoras de Colonias por mililitro (UFC/mL). En cada uno de los ensayos se realizó un control para evaluar las concentraciones iniciales de los conidios en estudio. Se evaluó la eficiencia del UV-C por diferencia entre el número de microorganismos antes y después del tratamiento con el mismo. (López y col. 2001) Determinación de la capacidad toxicogénica de las cepas de Alternaria antes y después de ser irradiadas para la producción de las micotoxinas AOH, AME y TA: Se inoculó en erlenmeyers conteniendo medio de cultivo a base de arroz con un 45% de humedad las distintas cepas de Alternarias. Los mismos fueron incubados durante 28 días en oscuridad a 25°C. Posteriormente se realizó la extracción para las toxinas AOH, AME y TA según Visconti et al. (1992). Los extractos obtenidos fueron analizados por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) en el laboratorio de Química Orgánica (UBA). La determinación de la concentración de toxina de cada extracto fue llevada a cabo a partir de curvas de calibración realizadas con soluciones estándar de cada toxina (AME: 1,8 µg/µl; AOH: 2,4 µg/µl; TA: 1,36 µg/µl) correlacionado el área del pico vs.concentración. La identidad de los picos fue confirmada mediante la co-inyección con el correspondiente estándar. RESULTADOS Y CONCLUSIÓN Se corroboró la identidad de las especies de las distintas cepas de Alternaria según E. G. Simmons (2007). Las cepas pertenecen a las especies de Alternaria alternata, Alternaria arborescens y Alternaria tenuissima. Análisis de la supervivencia de los conidios de las distintas cepas de Alternaria irradiados con UV-C: En la Fig. 1. se puede observar que si bien hay una reducción en la producción de los conidios para las distintas especies de Alternaria después de ser irradiadas, ninguna de las especies logró bajar 4 Log (equivalente a un 99.99% de eficiencia de muerte). Análisis de la producción de metabolitos secundarios: De las 17 cepas reactivadas de Alternaria, todas produjeron AOH y AME. Para la producción de TA, el 33,33%(1/3) del grupo-especie A. alternata y el 36,36% (4/11), pertenecientes al grupo-especie A. tenuissima, no tuvieron la capacidad de producir dicha micotoxina. Indistintamente de las cepas que no pudieron producir TA, todos los grupos-especies fueron capaces de producir los 3 tipos de micotoxinas. Cabe señalar que no en todos los casos el cien por ciento de las cepas que se evalúan son capaces de producir todas y cada una de las toxinas evaluadas, al menos en las condiciones ensayadas (Pose, 2007). Además, se observaron las concentraciones de las 3 clases de micotoxinas (AOH, AME y TA) antes y después de la exposición a las radiaciones UV-C. Si bien la producción de toxinas depende de la cepa y de la especie de la que se trate, podemos observar una tendencia al incremento en la capacidad de producir las micotoxinas. Es decir, si bien hay cepas que disminuyen su valor inicial en la concentración de la producción de micotoxinas, hay otras que aumentan de una manera muy significativa su valor inicial. CONCLUSIONES Todas las cepas estudiadas presentaron una diferencia significativa en cuanto a la supervivencia de los conidios (p