Factor de Crecimiento Nervioso beta (β-NGF) y su receptor TrkA en el sistema reproductor del macho de llama. Localización en espermatozoides.

SARI LUCIANA M.; CARRETERO M.I; ZAMPINI, RENATO; FUMUSO F.; BARRAZA DANIELA E.; ARGAÑARAZ, MARTIN E.; RATTO M.; APICHELA, SILVANA A.

Jornada; V Jornadas Internacionales. Instituto de Investigación y Tecnología en Reproducción Animal (INITRA); 2017

Factor de Crecimiento Nervioso beta (β-NGF) y su receptor TrkA en el sistema reproductor del macho de llama. Localización en espermatozoides.Sari L.M. 1, Carretero M.I. 2, Zampini R.1, Fumuso F.2, Barraza D. 1, Argañaraz M.E.1 Ratto M.3 y Apichela S.A.11INSIBIO (CONICET-UNT) 2INITRA (FCV-UBA)-CONICET 3Universidad Austral de ChileNuestra hipótesis es que el β-NGF del plasma seminal de llama se adhiere a los espermatozoides durante la eyaculación. Nos propusimos: 1- Localizar β-NGF y su receptor TrkA en espermatozoides epididimales (EE), eyaculados (EY) y con reacción acrosomal (RA); y 2- Conocer el origen del β-NGF seminal analizando su expresión en el aparato reproductor masculino.Espermatozoides: El semen se obtuvo por electroeyaculación de machos de llama adultos de la FCV-UBA. Luego se lavó dos veces en solución fisiológica a 37ºC (1:10) (800 x g 10 min). Parte del pellet de espermatozoides fue fijado sobre portaobjetos positivados. El resto fue tratado para inducir RA: los espermatozoides se incubaron 3 hs a 38°C, 100% de humedad y 5% de CO2 en TALP-BSA 6 mg/ml. Luego, se agregó ionóforo de calcio 5 µM (A23187) y se incubó 1 h. Se evaluó viabilidad y estado acrosomal con FITC-PNA/PI. Se realizaron frotis que se fijaron en Carnoy para inmunomarcacion. Los EE se obtuvieron post mortem en Tucumán. Se realizó disección de la cola del epididimo, lavado de los espermatozoides y frotis.Inmunofluorescencia: Los frotis de EE, EY y espermatozoides con RA se incubaron con Proteinasa K 2% (20 min a 37°C) y luego Tritón X-100 0,3%. Se bloqueó con BSA 1% (30 min a TA). Se incubó con anti-βNGF 1:200 o anti-TrkA 1:100, 3 hs a 37°C y luego con anticuerpo secundario biotinilado, 1:200 (20 min a TA) y con extravidina-FITC (1:2000). Se observó en microscopio de fluorescencia.RT-PCR: testículo, glándulas bulbouretrales, próstata y cabeza, cuerpo y cola del epidídimo se obtuvieron post mortem y se procesaron para extracción de ARN total. El ADNc se obtuvo por transcripción reversa de 1 µg de ARN con M-MLV y oligodT. Se diseñaron cebadores específicos para β-NGF y TrkA y se realizó PCR con 0,5 µl de ADNc. Como gen de referencia se empleó β-actina. Los productos se visualizaron en gel de agarosa al 1,5% y se calculó su expresión relativa por ImageJ. Para el análisis estadístico se aplicó ANOVA y test LSD de Fisher mediante InfoStat.Ambas proteínas se localizaron en la pieza media del espermatozoide. Se observó marca para TrkA en todos los casos. Sólo los EE y los espermatozoides RA poseen marca de β-NGF, lo que indicaría que este factor es aportado por el plasma seminal. A su vez la co-localización de β-NGF y de su receptor indicaría que β-NGF ejerce alguna acción sobre el espermatozoide.Se observó expresión de β-NGF y TrkA en todo el aparato reproductor. Para β-NGF fue mayor en próstata y cabeza del epidídimo (p