Estudio de péptidos derivados del alfa−core de la defensina DefSm2D de flores de Silybum marianum sobre conidios del hongo fitopatógeno Fusarium graminearum.

AGUSTINA FERNÁNDEZ; MARIANO GONZÁLEZ; ISMAEL MALBRÁN; FANNY GUZMÁN; LAURA SUSANA BAKÁS; SANDRA ELIZABETH VAIRO CAVALLI

Workshop; IV Workshop Péptidos terapéuticos para Bio-aplicaciones; 2021

Laboratorio de Síntesis de Péptidos del Núcleo de Biotecnología Curauma de la Pontificia Universidad Católica de Valparaíso

Las defensinas vegetales son pequeñas proteínas catiónicas ricas en cisteína cuya principal actividad reportada es la antifúngica, aunque también han sido descriptas muchas otras acciones para estas proteínas. En vista su alto grado de conservación estructural, las diferencias en las especificidades y múltiples actividades pueden ser atribuidas a la variación en la secuencia aminoacídica y la distribución de cargas de los loops expuestos al solvente que modularían su función biológica. En estos loops se localizan dos motivos importantes para su actividad, el -core (GXCX3?5C), un motivo relevante para los péptidos antimicrobianos en general, y el α-core (GXCX3?5C) que no ha sido estudiado en profundidad. En estudios previos demostramos que péptidos sintéticos derivados de estas regiones fueron activos en concentraciones micromolares frente al hongo fitopatógeno Fusarium graminearum y caracterizamos su acción sobre sus conidios. Con el fin de profundizar el conocimiento del -core, se diseñaron nuevos péptidos modificando el péptido base SmAP1-21 (Secuencia: KLCEKPSKTWFGNCGNPRHCG; Concentración Inhibitoria MínimaCIM: 32 μM), que demostró tener capacidad permeabilizadora de membrana y produjo un efecto morfológico distintivo a nivel de la pared celular de los conidios tratados. Se realizó la síntesis química de péptidos en fase sólida utilizando la estrategia Fmoc, se purificaron y analizaron por HPLC-RP en columna C18 (gradiente de acetonitrilo 0-70%; 0,05% TFA) y se caracterizaron por ESI-MS y CD. Se realizó la determinación de la CIM frente a F. graminearum, se evaluó el tiempo necesario para producir la muerte celular, la capacidad permeabilizadora de membrana por microscopía confocal y la presencia de estrés oxidativo en los conidios a través de la detección de ROS por microscopía confocal y fluorimetría. Derivatizando con fluoresceína dos de los péptidos estudiados, se evaluó también la localización subcelular por microscopía confocal. Todos los ensayos fueron realizados a la CIM.Se diseñaron y sintetizaron tres péptidos, SmAPH19R, en donde se modificó la His19 por una Arg respecto al péptido base; SmAPH19A, en el que se modificó la His19 por una Ala y cSmAPC14S, un péptido cíclico en el que se realizó un protocolo para promover la formación de un enlace disulfuro intramolecular y se modificó la Cys14 por una Ser. Los péptidos resultaron ser activos frente a F. graminearum (SmAPH19R: 40 μM, SmAPH19: 100 μM y cSmAPC14S: 70 μM). Tanto SmAPH19R como cSmAPC14S produjeron permeabilización de la membrana de conidios, lo cual no se verificó para SmAPH19A. Los tres péptidos indujeron estrés oxidativo en los conidios tratados a través de la producción de ROS. SmAPH19R produjo la muerte de los conidios en 3 h, SmAPH19A en 6 h y cSmAPC14S, en 30 min. Los resultados de microscopía confocal mostraron que SmAPH19R y SmAPH19A se localizaron en la pared celular de los conidios. El cambio de His por Ala redujo la actividad respecto al péptido base y produciría un cambio en el mecanismo de acción, debido a que no se produjo permeabilización de membrana en las condiciones del ensayo. Si bien el péptido cSmAPC14S exhibió una CIM mayor respecto al péptido base, resultó ser el más letal.