INVESTIGADORES
CARNEVALE MatÍas Emanuel
congresos y reuniones científicas
Título:
Expresión de proteínas recombinantes para la generación de anticuerpos anti-receptores de hormona de crecimiento de pez cebra (Danio rerio)
Autor/es:
CARNEVALE, MATÍAS E.; DI PRINZIO, CECILIA M.; ARRANZ, SILVIA E.
Lugar:
Rosario
Reunión:
Jornada; III Jornadas de Ciencia y Tecnología - Difusión de la Producción Científica y Tecnológica de la UNR; 2009
Institución organizadora:
Secretaria de Ciencia y Tecnología de la UNR
Resumen:
Los peces poseen patrones y estrategias de crecimiento únicos dentro de los vertebrados, siendo la hormona de crecimiento (GH) una de las hormonas más importantes en el eje endocrinológico que controla el mismo. GH es una hormona hipofisiaria con efectos pleiotrópicos, la cual ejerce su acción al unirse a su receptor en los órganos blanco. En nuestro laboratorio se han estudiado y caracterizado dos tipos de receptores para la GH en pez cebra (Danio rerio): zGHRa y zGHRb. Las características funcionales, mecanismos de regulación y roles en el desarrollo embrionario de dicho receptor aún no se conocen. Para poder dilucidar algunos de estos interrogantes, y avanzar en la caracterización funcional de los receptores; el objetivo de este trabajo fue producir anticuerpos policlonales específicos, en conejo, para zGHRa y, en ratón, para zGHRb. Para ello, a partir de los ADNc completos de los receptores, se amplificaron mediante PCR, utilizando cebadores específicos, las regiones extracelulares de los mismos (exGHRs). Con los fragmentos obtenidos se realizaron dos clonados sucesivos; primero en el vector pGEM-T Easy, y posteriormente en vectores de expresión de la serie pGEX; éstos últimos permiten expresar las exGHRs como proteínas de fusión, facilitando su posterior identificación y purificación. Con estas construcciones se transformaron bacterias E.coli DH5α, las cuales fueron sometidas a diferentes condiciones de inducción. Mediante Western blot se determinó la existencia de la proteína de fusión GST-exGHRa formando cuerpos de inclusión bajo todas las condiciones de inducción probadas. Para obtener proteínas recombinantes en cantidad suficiente, empleamos una concentración final de 1 mM de isopropil-β-D-tiogalactósido (IPTG) durante 2 horas a 37ºC. Las bacterias fueron lisadas por sonicación, para obtener un extracto proteico total; se separaró GST-exGHRa por SDS-PAGE y se aisló por electroelución. Con la proteína recombinante obtenida se realizó una emulsión, complementada con coadyuvante de Freund, que fue inyectada en un conejo de experimentación. Una vez que se obtuvo su suero, finalizadas las inoculaciones, se determinó la existencia, especificidad y el título óptimo de los anticuerpos mediante Western blot, para lo cual se enfrentaron con extractos proteicos de embriones y tejidos adultos de pez cebra.