Preparation of a three-dimensional extracellular matrix by decellularization of rabbit livers

NARI GUSTAVO ADRIAN; CID MARIANA ; COMIN ROMINA; REYNA MUSSO LAURA; JURI GUSTAVO; TABORDA RICARDO; SALVATIERRA NANCY ALICIA

REVISTA ESPANOLA DE ENFERMEDADES DIGESTIVAS

ARAN EDICIONES

Lugar: Comunidad de Madrid, España; Año: 2013 vol. 105 p. 138 - 143

1130-0108

Introduction: the availability of transplantable livers is not sufficient to fulfill the current demand for grafts, with the search for therapeutic alternatives having generated different lines of research, one of which is the use of decellularized three-dimensional biological matrices and subsequent cell seeding to obtain a functional organ.Objective: to produce a decellularization protocol from rabbit liver to generate a three-dimensional matrix.Methods: a combination of physical, chemical (Triton X-100 and SDS) and enzymatic agents to decellularize rabbit livers was used. After 68 h of retrograde perfusion, a decellularized translucent matrix was generated. To evaluate if the decellularization protocol was successful, with the extracellular matrix being preserved, we carried out histological (light microscopy and scanning electron microscopy) and biochemical (DNA quantification) studies.Results: the decellularization process was verified by macroscopic observation of the organ using macroscopic staining, which revealed a correct conservation of bile and vascular trees. A microscopic observation corroborated these macroscopic results, with the hematoxylin-eosin staining showing no cells or nuclear material and the presence of a portal triad. Wilde´s staining demonstrated the conservationof reticulin fibers in the decellularized matrix. In addition, scanning electron microscopy revealed a preserved Glisson´s capsule and a decellularized matrix, with the DNA quantification being less than 10 % in the decellularized liver compared to control. Finally, the time taken to develop the decellularization protocol was less than 96 hours.Conclusions: the proposed decellularization protocol was correct, and was verified by an absence of cells. The hepatic matrix had preserved vascular and bile ducts with a suitable three-dimensional architecture permitting further cell seeding. Introducción: el número de hígados trasplantables es insuficiente para satisfacer las necesidades actuales de la demanda de injerto. La búsqueda de alternativas terapéuticas ha generado diferentes líneas de investigación, una de ellas es la utilización de matrices biológicas tridimensionales descelularizadas y la posterior siembra celular para obtener un órgano funcional. Objetivo: obtención de un protocolo de descelularización de hígado de conejo que genere una matriz hepática tridimensional. Métodos: Una combinación de detergentes (Triton x-100 y SDS), agentes físicos y enzimáticos se utilizaron para descelularizar hígados de conejo. Los órganos se pefundieron en forma retrograda con distintos agentes químicos durante 68 horas. Luego los hígados se examinaron por técnicas morfológicas (microscopia óptica y electrónica de barrido) y bioquímicas (cuantificación de ADN) para evaluar una correcta descelularización así como la obtención de una matriz extracelular preservada. Resultados: La observación macroscópica del órgano permitió inferir la descelularización del mismo. Las tinciones macroscópicas utilizadas mostraron una correcta conservación de los árboles biliar y vascular. Por otro lado, la observación microscópica del hígado permitió corroborar los resultados macroscópicos observados, la tinción de hematoxilina-eosina mostro ausencia de células y de material nuclear así como la presencia de la triada portal. La tinción de Wilde evidencio la conservación de las fibras de reticulina en la matriz descelularizada. Asimismo, la Microscopia Electrónica de Barrido revelo una capsula de Glisson conservada y la descelularización de la matriz. Además la cuantificación de ADN fue menor al 10% en el hígado descelularizado con respecto al hígado control. Finalmente, el tiempo utilizado para la descelularización fue inferior a las 96 horas. Conclusión: el protocolo de descelularización propuesto fue apropiado ya que se verificó una ausencia de células y una matriz hepática con conductos vasculo biliares conservados y con una arquitectura tridimensional adecuada para una futura siembra celular.