INVESTIGADORES
ROBERT Maria Celeste
congresos y reuniones científicas
Título:
Optimización de la carga y remoción del agente crioprotector Dimetilsulfóxido en Hepatocitos de Rata mediante un Modelo Matemático
Autor/es:
TOMATIS, C; JUAN DE PAZ L.; ROBERT, MARIA CELESTE; GUIBERT E.E.
Lugar:
Rosario
Reunión:
Jornada; XIII Jornada de Ciencia y Tecnología; 2019
Institución organizadora:
Universidad Nacional de Rosario
Resumen:
INTRODUCCIÓN. La utilización de agentes crioprotectores (ACPs) es una necesidad en los protocolos de criopreservación ya que minimizan los efectos nocivos del proceso de cristalización sobre las muestras biológicas. Sin embargo, para evitar su toxicidad resultan críticos ciertos parámetros como concentración, tiempo de exposición y temperatura. La elaboración de protocolos con ACPs permeables a la membrana celular exige un máximo cuidado, tanto en la carga como en la remoción, ya que las diferencias de permeabilidad de membrana al agua y a los ACPs pueden originar desbalances osmóticos temporarios potencialmente dañinos. En el presente trabajo se pretende racionalizar el diseño de los protocolos de carga y remoción del ACP dimetilsulfóxido (DMSO) en hepatocitos aislados de rata, mediante la utilización de un modelo matemático de transporte. METODOLOGÍA. Se realizó la evaluación de tolerancia osmótica de hepatocitos de rata Sprague Dawley. Para ello, las células aisladas se resuspendieron en soluciones de diferentes osmolalidades, se incubaron 15 min con cada solución y se hizo recuento celular en cámara de Neubauer con Trypan Bluepara el cálculo del rendimiento y viabilidad. Se construyeron gráficas de rendimiento y viabilidad vs osmolalidad y se determinaron los límites de osmolalidades que otorguen el 80 % del rendimiento. Se sacaron fotos en las que se midieron los diámetros con los cuales se calcularon los volúmenes y volúmenes normalizados. Se construyó el gráfico de Van´t Hoff (volúmenes normalizados vs 1/osm) a fin de determinar el volumen de agua osmóticamente inactivo (ordenada al origen) necesario para el modelado matemático. Se simuló numéricamente la respuesta de las células al 10 % de DMSO mediante el formalismo de Kedem-Katchalsky (K-K) (1) ampliamente utilizado para describir el flujo de solutos y soluciones no electrolíticas a través de la membrana, con los siguientes parámetros específicos de la membrana del hepatocito a 4 °C: Lp=1.11 μm/atm*min, Pc=7.70 μm/min, σ=0.581. Se diseñó un protocolo de carga y uno de descarga que minimicen el tiempo de exposición al ACP, sin comprometer la integridad de la membrana trabajando dentro de los límites osmóticos hallados. RESULTADOS. Del estudio de tolerancia osmótica obtuvimos los siguientes límites: 105±3 y 1064±15 mOsm/kg H 2 O. El volumen osmóticamente inactivo obtenido del gráfico de Van´t Hoff fue 0.41 del volumen celular isotónico. El modelado de K-K bajo los límites osmóticos definidos arrojó el siguiente protocolo: la carga en un paso con incubación de 3 minutos y la descarga en un paso, posterior centrifugado, descarte de sobrenadante y resuspendido en el volumen inicial. CONCLUSIONES. El presente trabajo demuestra la utilidad del modelado matemático al momento de diseñar un protocolo de criopreservación. Resulta una alternativa racional válida frente a la utilización de protocolos empíricos ampliamente utilizados, optimizando el tiempo de experimentación, los recursos económicos y la utilización de animales.