INVESTIGADORES
ROBERT Maria Celeste
congresos y reuniones científicas
Título:
EVALUATION OF HUMAN SPERM DNA ALTERATIONS: COMET ASSAY
Autor/es:
M. CELESTE ROBERT; ADRIANA CAILLE; MARÍA JOSE MUNUCE; SERGIO GHERSEVICH
Lugar:
Rosario
Reunión:
Congreso; V Congreso, XXII Reunión Anual; 2002
Institución organizadora:
Sociedad de Biología de Rosario
Resumen:
"EVALUACIÓN DE ALTERACIONES EN EL ADN ESPERMÁTICO HUMANO: ENSAYO DEL COMETA" Robert, Celeste M; Caille, Adriana M; Munuce, Maria José; Ghersevich, Sergio A Laboratorio de Estudios Reproductivos, Area Bioquímica Clínica y Fisiopatología, Facultad de Ciencias Bioquímicas Farmacéuticas, Universidad Nacional de Rosario La investigación en el campo de la infertilidad masculina ha demostrado una relación significante entre la función espermática alterada y el estrés oxidativo, el cual principalmente se debería a la exposición excesiva a especies reactivas del oxígeno (ERO). Las ERO serían capaces de generar oxidaciones de bases y roturas en la cadena de ADN. En el caso de producirse la fecundación, estas alteraciones en el ADN podrían alterar el desarrollo del embrión o de algunas de las progenies celulares implicadas en el mismo. El objetivo del presente trabajo fue investigar el efecto sobre el ADN de espermatozoides humanos causado por estrés oxidativo inducido por H2O2 o la exposición a radiación ionizante mediante el desarrollo del método de electroforesis de células aisladas en gel de agarosa o ensayo del cometa, modificando ciertos parámetros de dicho ensayo. Se utilizaron muestras de semen de donantes normozoospérmicos que fueron analizadas según criterios establecidos por la O.M.S. Los espermatozoides progresivos se recuperaron mediante gradientes de densidad y fueron expuestos a concentraciones crecientes de H2O2 (17,6 M a 140,8M) o radiación UV (15 W por 1 h). Luego las células espermáticas incluídas en geles de agarosa al 1 % fueron sometidas a electroforesis en condiciones alcalinas (20 V por 5 min). El ADN espermático fue teñido por el método de plata. La longitud total de migración del ADN celular para cada grupo de tratamiento se evaluó microscópicamente. Para el análisis estadístico de los resultados entre los distintos tratamientos se utilizó el test ANOVA seguido por el test de Dunn o cuando hubo un único tratamiento el test t de Student. Al evaluar los resultados de la variación de los tiempos de electroforesis se encontró que un tiempo de electroforesis de 5 min resultó en una migración del ADN más definida o a lo sumo similar a aquellas encontradas al utilizar 10 o 15 min, por lo cual se continuó trabajando con el menor tiempo. El ensayo del cometa permitió establecer un aumento significativo en la migración del ADN espermático en espermatozoides tratados con las distintas concentraciones de H2O2 respecto de los controles (P < 0.001), y este efecto fue dosis dependiente. El tratamiento con radiación UV resultó en una disminución significativa de la migración del ADN espermático respecto de los controles no expuestos (P < 0.001). Los resultados indicaron que el ensayo del cometa permitió detectar cambios provocados en el ADN espermático aún por la concentración más baja de H2O2 utilizada, así como también el efecto causado por la exposición a la radiación UV. En este último caso, a diferencia del tratamiento con H2O2, la radiación favorecería la formación de uniones cruzadas entre las bases nucleotídicas. Esto explicaría la menor distancia de migración observada en el ADN de los espermatozoides irradiados. El ensayo del cometa aparece como un método sensible para evaluar daños potenciales al ADN en espermatozoides humanos.