CRIOPRESERVACIÓN DE CELULAS NEURONALES DE RATA POR EL MÉTODO DE ENFRIAMIENTO LENTO BAJO NUCLEACIÓN DE HIELO ESPONTÁNEA

MARÍA C. ROBERT; JUAN DE PAZ L.; BERARDI F.; BALABAN C.L.; GRAF D.; SILVIA GAZZIN; CLAUDIO TIRIBELLI; RODRIGUEZ J.V.

Rosario

Jornada; VII Jornada de Ciencia y Tecnología, Secretaría de Ciencia y Tecnología, UNR; 2013

Secretaría de Ciencia y Tecnología, UNR

CRIOPRESERVACIÓN DE CELULAS NEURONALES DE RATA POR EL MÉTODO DE ENFRIAMIENTO LENTO BAJO NUCLEACIÓN DE HIELO ESPONTÁNEA. Robert M.C.1, Juan de Paz L.1,2, Berardi F.1,Balaban C. L.1, Graf D.2, Gazzin S.3, Tiribelli C.3, Rodriguez J. V.1 1Centro Binacional (Argentina-Italia) de Investigaciones en Criobiología Clínica y Aplicada (CAIC), UNR.2 Servicio de Electrónica y Óptica, FCByF, UNR, Argentina. 3Fondazione Italiana Fegato, Centro Studi Fegato, Trieste, Italia. E-mail: celeste_robert@hotmail.com La criopreservación de células neurales comenzó a ser interesante debido al trasplante exitoso de tales tejidos. Es importante destacar que han sido desarrollados diversos estudios para criopreservar células neuronales sin suficiente éxito. El objetivo de nuestro trabajo fue estudiar los efectos de la velocidad de enfriamiento y la temperatura de inmersión en nitrógeno líquido (LN2) sobre la viabilidad y funcionalidad de células granulares primarias después del calentamiento post criopreservación y cultivo. Las células granulares fueron obtenidas de cerebelos de ratas Wistar de 8 días de edad. La viabilidad celular fué evaluada por Exclusión de Azul Tripán (TBE). Alícuotas de 20x106 células viables fueron criopreservadas en Neuron Medium con 10 % Me2SO a diferentes velocidades de enfriamiento (0.4, 1.2, 1.9 and 3.1°C/min) por la metodología de enfriamiento lento. Previamente las células fueron incubadas 10 min a 10°C para permitir la difusión del agente crioprotector. Para el protocolo de criopreservación, las células se sometieron a diferentes velocidades de enfriamiento utilizando distintas barras de Cobre como unidades de transferencia térmica (1/4, 3/8, 1/2 y 5/8 pulgadas de diámetro). Se generó un gráfico de velocidad de enfriamiento en función del tiempo registrando la temperatura de las muestras y del baño de metanol cada 10 seg. La velocidad de enfriamiento se calculó por regresión lineal antes del pico de cristalización espontánea. Las células criopreservadas fueron descongeladas en baño a 39 °C y diluidas 1/5 con Neuron Medium. El proceso de criopreservación fue evaluado estudiando la viabilidad post criopreservación y la capacidad de supervivencia por x días. Se calculó la viabilidad celular (CV, células viables/células totales x 100) post criopreservación, y a 2, 7 y 14 días de cultivo in vitro por el test TBE. También, se calculó el rendimiento de células viables (RCV, cél. viables post criopreservación-calentamiento/cél. viables antes de la criopreservación x 100). Cuando las células fueron enfriadas hasta una temperatura entre -20.0 y -28.0°C antes de sumergirlas en LN2, la CV post-calentamiento se incrementó con la velocidad de enfriamiento, siendo de 33.8 ± 23.2 % para 0.4°C/min; 27.0 ± 16.7 % para 1.2°C/min; 31.1 ± 10.5 % para 1.9°C/min; y 46.7 ± 32.0 % para 3.1°C/min (n ≥ 4). Cuando la temperatura fue entre -40.0° y -55.0°C, la CV mejoró significativamente 71.6 ± 15.3 % para 1.2°C/min; 82.3 ± 6.0 % para 1.9°C/min; y 78.6 ± 10.0 % para 3.1°C/min (n ≥ 5). No observamos dependencia del RCV con la velocidad de enfriamiento a temperaturas de inmersión en LN2 entre -20.0° y -28.0°C. En contraste, cuando la temperatura de inmersión fue entre -40.0° y -55.0°C, se obtuvieron mayores RCV, 12.7 ± 8.3 % para 1.2°C/min, 14.61 ± 10.1 % para 1.9°C/min y 26.0 ± 10.9 % para 3.1°C/min (n ≥ 5). Sólo las células criopreservadas a velocidades de 1.2, 1.9, y 3.1°C/min (temperatura de inmersión en LN2 entre -40.0° a -55.0°C) fueron capaces de adherirse a las placas de cultivo, desarrollar axones y permanecer en cultivo por al menos 14 días. La mejor condición para la criopreservación de células neuronales granulares de rata fue a una velocidad de enfriamiento de 3.1°C/min en combinación con una temperatura de inmersión en LN2 entre -40.0 a -55.0°C.