Cromatografía líquida de alta eficiencia acoplada a espectrometría de masas para la caracterización de flavonoides

CHEMINET G.; BARONI M.V.; PODIO, N.S.; LINGUA M.; ASIS RAMÓN; FABANI, M.P.; WUNDERLIN D.A.; DI PAOLA NARANJO R.D.

Los Cocos, Córdoba

Congreso; Primer Congreso Argentino de Espectrometría de Masas; 2012

Sociedad Argentina de Espectrometría de Masas

Los flavonoides son fitoquímicos ampliamente distribuidos en la naturaleza, encontrándose en numerosos frutos, plantas y semillas. Su presencia en productos alimenticios ha sido muy estudiada recientemente debido a sus propiedades fisiológicas y a sus potenciales beneficios para la salud como consecuencia de su acción antioxidante, quimiopreventiva y captadora de radicales libres. La familia de los flavonoides se divide a su vez en varias subclases que comparten una estructura básica conformada por un esqueleto C6-C3-C6, compuesto por dos anillos fenilos (A y B) ligados a través de un anillo heterocíclico oxigenado (C) (Fig. 1). Las diferencias entre las subclases radican en el grado de hidroxilación, sustituciones y conjugaciones, y el grado de polimerización; esta multitud de variaciones da lugar a flavanoles, flavonoles, flavonas, flavanonas y chalconas, entre otros. Estos compuestos pueden encontrarse libres, glicosilados o acilglicosilados, mayoritariamente en la posición 3 y con menor frecuencia en las posiciones 7, 3´y 4´. Numerosos trabajos demostraron que la estructura del flavonoide se correlaciona con su actividad biológica y antioxidante, por ello es importante la determinación funcional y estructural de estas moléculas, utilizando técnicas como la espectrometría de masas (MS). El objetivo del presente trabajo fue desarrollar un método de HPLC-ESI-MS/MS para caracterizar flavonoides en diferentes matrices alimenticias (uvas tintas, pistacho, tomate, yerba mate, trigo y naranja). Se utilizó un HPLC (Agilent Technologies), acoplado a un detector con arreglo de diodos (DAD) y un espectrómetro de masas (MS). La separación se realizó en una columna de fase reversa (C18) (5 mm, 250mm, 4.60 mm i.d.), termostatizada a 35 °C y aplicando un gradiente de solventes (A: ácido fórmico 0,5% v/v; B: ácido fórmico 0,5% v/v en metanol) durante 41 min. El flujo aplicado fue de 0,4 mL/min. El MS consta de dos analizadores, un cuadrupolo seguido de un tiempo de vuelo (microTof-Q II, Bruker). Se utilizó una interfase de ionización por electrospray (ESI) y los espectros fueron registrados en modo negativo. La optimización del método de análisis se llevó a cabo utilizando estándares comerciales representando a las subfamilias de flavonoides analizadas en el presente trabajo. Las vías de fragmentación de flavonoides glicosilados obtenidos por CID, permiten obtener información importante de los patrones de sustitución de estos compuestos. De esta forma, el método desarrollado permitió la identificación de 43 flavonoides, algunos de los cuales se muestran en la Tabla 1. Los mismos fueron identificados por sus tiempos de retención (tr), espectros UV-Vis, relaciónes m/z, espectros de MS2 y comparación con datos bibliográficos. Para los compuestos glicosilados, en todos los casos se observó la eliminación del residuo glicosídico, generando como fragmento mayoritario el aglicón correspondiente, debido a que la unión hemiacetal es relativamente lábil (ej. compuestos 4, 6, 7, 10, 11, etc.). Cuando un flavonoide esta sustituido por dos residuos glicosídicos, es posible diferenciar si se trata de un biósido o un diglicósido por su patrón de fragmentación. Por ejemplo, el compuesto 5 registra el fragmento [M-308]- correspondiente a la pérdida conjunta de un residuo ramnosa-hexosa, indicando la presencia de un sustituyente diglucósido en una única posición (eriocitrina/neoeriocitrina). Teniendo en cuenta las mismas consideraciones, fue posible identificar los compuestos 8, 10 y 11. Por otra parte, se identificaron naringenina (flavanona) y naringenina-chalcona por sus espectros UV-Vis. Debido a que ambos compuestos poseen la misma m/z y el mismo tr, fue posible diferenciarlos debido a que la naringenina posee un máximo de absorción a 289 nm, mientras que la chalcona posee un máximo de absorción a 366 nm. Asimismo, se observaron rupturas características de aglicones de flavonoides (CO2, H2O, C2H2O, etc.) que colaboraron en la identificación de algunos de los compuestos encontrados (20, 21, 22, etc.). En conclusión, cabe destacar que la utilización de una doble detección acoplada a la cromatografía líquida (HPLC-DAD-MS/MS) permitió realizar la identificación de subfamilias de flavonoides presentes en diferentes alimentos con potenciales propiedades nutracéuticas, la cual puede ser extendida a otras matrices alimenticias.