Sobre-expresión, purificación y estudios estructurales de Arginina Quinasa de T.cruzi

PABLO M FERNANDEZ; GABRIEL VALDIVIESO; JOËL WALICKI; CARLOS F AGUILAR

Congreso; XIX Reunión Científica Anual de la Sociedad de Biología de Cuyo; 2001

La proteína arginina quinasa es miembro de una familia de fosfotransferasas y cataliza la transferencia irreversible de un grupo fosfato desde una molécula de ATP a un aceptor guanidino, el cual puede ser un aminoácido (por ej. arginina o lombricina) o un carboxilato (por ej. creatina o glicociamina). Recientemente ha sido caracterizada enzimática y genéticamente, la arginina quinasa de T. cruzi, el agente causal de la enfermedad de Chagas. La arginina quinasa de T. cruzi se encuentra implicada en vías de señalización que son totalmente diferentes de las de mamíferos, lo que convierte a esta proteína en un posible blanco para la quimioterapia en la enfermedad de Chagas. Con el objetivo de comprender mejor las propiedades estructurales de arginina quinasa de T. cruzi, la secuencia codificante completa fue clonada en el vector pRSETA, un plásmido que se transcribe bajo el control de un promotor T7 e incluye una cola de polihistidinas. La expresión se realizó en la cepa BL21 de E. coli, en medio 2YT con ampicilina y cloranfenicol, e induciendo por 2 h a 37°C con 1 mM de isopropyl-1-thio-b-D-galactopyranoside. Las bacterias fueron lisadas por sonicación y la proteína arginina quinasa producida fue purificada a partir de los cuerpos de inclusión, que fueron resuspendidos en solución de Buffer Tris 50 mM y Urea 8 M. Se utilizó luego una columna de afinidad preparada con resina Ni.NTA. La elusión se realizó con Buffer Tris 50 mM, Urea 6 M, e imidazol 200 mM. Posteriormente la proteína fue reconformada por dilución rápida en Buffer Tris 50 mM sin Urea, a 4°C con agitación. El nivel de expresión de la proteína fue > 10 mg/litro de cultivo. Para la realización de los estudios de cristalización las muestras fueron concentradas hasta un valor de entre 5 y 10 mg/ml, y se ensayaron las condiciones óptimas con el kit Crystal Screen (Hampton Research).