integrasas de clase 1 funcionales in vivo en cepas ambientales

NARDELLI MAXIMILIANO; QUIROGA MARÍA PAULA; CENTRÓN DANIELA

Ciudad Autónoma de Buenos Aires

Jornada; 157º Jornada Científica titulada: Resistencia bacteriana y uso racional de los antibióticos; 2013

Academia Nacional De Farmacia y Bioquímica de la República Argentina

Los integrones son estructuras genéticas presentes en el 17% de los genomas bacterianos capaces de mediar la recombinación sitio-específica de cassettes móviles, dando lugar así a una región variable muy dinámica que puede captar y a la vez donar genes con funciones muy variadas. Están compuestos de una integrasa, su sitio de reconocimiento y un promotor para la expresión de los cassettes que integran. Se han reportado innumerables casos de integrones asociados a la multirresistencia antibiótica, confiriendo resistencia a casi todos los antibióticos de uso médico. Los integrones de clase 1 son los más frecuentes en aislamientos clínicos, pero poco se sabe respecto de su dispersión en el ámbito no clínico. De hecho, la funcionalidad de las  integrasas de clase 1 ambientales no ha sido aún analizada. El objetivo de este trabajo es evaluar la funcionalidad de integrasas de clase 1 presentes en bacterias ambientales mediante ensayos in vivo. Se dispuso de 11 aislamientos de agua, suelo y feca de zorro provenientes de sitios con distinto grado de urbanización de Iguazú y de Tierra del Fuego. La funcionalidad de la integrasa se determinó por la capacidad de integración de los cassettes aadB y blaVIM-2 de resistencia a gentamicina y carbapenemes, respectivamente. Cada cassette fue incorporado en la bacteria ligado a un plásmido ColE1 comercial dentro de la estructura attI1-aadB-attC o attI1- blaVIM-2 -attC. De los 11 aislamientos, 5 resultaron ser competentes naturales (Escherichia coli 4IgSN1, Pantoea dispersa 10FZSS14, Pseudomonas sp. 1SL5, Acinetobacter sp. 1IgSLAM1 y Acinetobacter sp. 1IgSN3), por lo que la transformación sólo requirió agregar el plásmido a 50μl de cultivo bacteriano. Los 6 restantes (Aeromonas media 1AC2, Vibrio sp. 1AC4, Aranicola sp. 9AL34, Pseudomonas sp. 7AN1, Enterobacter sp. 10AL1 y Enterobacter sp. 1IgSLAM2) fueron hechos químicamente competentes con CaCl2 y transformados por shock térmico. No pudieron seleccionarse los transformantes positivos a partir de la resistencia brindada por el vector, por lo que se procedió a sembrar en placa una dilución del cultivo 18hs post-transformación, para luego extraer el ADN total de la confluencia. La inserción del cassette en el sitio attI1 nativo se evidenció por PCR con cebadores específicos y secuenciación en todos los aislamientos salvo en Pseudomonas sp. 7AN1. El cassette inserto fue mantenido en ausencia de presión de selección antibiótica al menos 30 días post-transformación en medio líquido subcultivando periódicamente en las cepas de E. coli y Pseudomonas sp. competentes naturales. Además, en estos aislamientos la presencia del cassette inserto, ya sea aadB y blaVIM-2 no demostraron tener un costo sobre el fitness de la bacteria en un experimento de competencia entre la cepa con y sin el cassette. Estos resultados plantean un escenario en el cual las bacterias provenientes tanto de la clínica como del ambiente intercambian material genético a través de un flujo bidireccional, siendo las bacterias ambientales reservorio de cassettes de resistencia antibiótica, y, al mismo tiempo, pueden brindar a las bacterias patógenas de humanos de nuevos cassettes con las funciones requeridas para la supervivencia en ambientes de stress, tal como es el nicho intrahospitalario.