Funcionalidad in vivo de integrasas de clase 1 en aislamientos ambientales

NARDELLI MAXIMILIANO; PIEKAR, MARÍA; CHAMOSA, LUCIANA; D'AMICO GONZÁLEZ, GABRIELA; QUIROGA MARÍA PAULA; CENTRÓN DANIELA

Ciudad Autónoma de Buenos Aires

Congreso; XIII Congreso Argentino de Microbiología 2013 y II Congreso de Microbiología Agrícola y Ambiental 2013; 2013

Asociación Argentina de Microbiología

Los integrones son estructuras genéticas presentes en algunas bacterias capaces de mediar la recombinación sitio-específica de cassettes móviles, dando lugar así a una dinámica región variable. Están compuestos de una integrasa, su sitio de reconocimiento y un promotor para la expresión de los cassettes que integran. Se han reportado innumerables casos de integrones asociados a la multirresistencia antibiótica, confiriendo resistencia a casi todos los antibióticos de uso médico. Los integrones de clase 1 son los más frecuentes en aislamientos clínicos, pero poco se sabe respecto de su dispersión en el ámbito no clínico. La funcionalidad de integrasas de clase 1 ambientales no ha sido aún analizada. El objetivo de este trabajo es evaluar la funcionalidad de integrasas de clase 1 presentes en bacterias ambientales mediante ensayos in vivo. Se dispuso de 11 aislamientos de agua, suelo y feca de zorro provenientes de sitios con distinto grado de urbanización de las ciudades de Iguazú y Tierra del Fuego. La funcionalidad de la integrasa se determinó por la capacidad de integración del cassette aadB de resistencia a gentamicina. El mismo fue incorporado en la bacteria ligado a un plásmido ColE1 comercial dentro de la estructura attI1-aadB-attC. De los 11 aislamientos, 5 eran competentes naturales (Escherichia coli 4IgSN1, Pantoea dispersa 10FZSS14, Pseudomonas sp. 1SL5, Acinetobacter sp. 1IgSLAM1 y Acinetobacter sp. 1IgSN3), por lo que la transformación sólo requirió agregar el plásmido a 50μl de cultivo bacteriano. Los 6 restantes (Aeromonas media 1AC2, Vibrio sp. 1AC4, Aranicola sp. 9AL34, Pseudomonas sp. 7AN1, Enterobacter sp. 10AL1 y Enterobacter sp. 1IgSLAM2) fueron hechos químicamente competentes con CaCl2 y transformados por shock térmico. No pudieron seleccionarse los transformantes positivos a partir de la resistencia brindada por el vector, por lo que se procedió a sembrar en placa una dilución del cultivo 18hs post-transformación, para luego extraer el ADN total de la confluencia. La inserción del cassette en el sitio attI1 nativo se evidenció por PCR con cebadores específicos y secuenciación en todos los aislamientos salvo en Pseudomonas sp. 7AN1. El cassette inserto fue mantenido en ausencia de presión de selección antibiótica al menos 30 días post-transformación en medio líquido subcultivando periódicamente en las cepas de E. coli y Pseudomonas sp. competentes naturales. Además, en estos aislamientos la presencia del cassette inserto no demostró tener un costo sobre el fitness de la bacteria en un experimento de competencia entre la cepa con y sin el cassette. Estos resultados plantean un escenario en el cual las bacterias provenientes tanto de la clínica como del ambiente intercambian material genético a través de un flujo bidireccional, siendo las bacterias ambientales reservorio de cassettes de resistencia antibiótica, y, al mismo tiempo, brindan a las bacterias patógenas de humanos de nuevos cassettes con variadas funciones.