Obtención de un clon infeccioso para el arenavirus Tacaribe

S FOSCALDI; ME LOUREIRO; C MAROTTE; A D´ANTUONO; N LOPEZ

Capital Federal

Congreso; XI Congreso Argentino de Virología; 2015

Sociedad Argentina de Virología

Lafamilia Arenaviridae incluye virus productores de fiebres hemorrágicas enhumanos, tales como el virus Junin, así como virus no patógenos como el virusTacaribe (TCRV), prototipo de los arenavirus del Nuevo Mundo. TCRV es un virusenvuelto, cuyo genoma está constituido por dos segmentos de ARN de cadenasimple (llamados S y L). Ambos segmentos usan una estrategia ?ambisentido? paracodificar dos proteínas: la nucleoproteína (NP) y el precursor (GPC) de lasglicoproteínas de envoltura en el ARN S;  la ARN polimerasa viral (L) y laproteína Z, esencial para la morfogénesis viral, en el ARN L. Las proteínas NPy L son necesarias y suficientes para sostener la transcripción y replicacióndel genoma viral. En este trabajo hemos generado un sistema de genética reversa para la obtenciónde TCRV infeccioso a partir de plásmidos transfectados en células de mamífero.En primer lugar, se construyeron los plásmidos pSag y pLagWT que expresan,respectivamente, la copia complementaria completa del ARN S y del ARN L de TCRVbajo el control del promotor de la ARN polimerasa del fago T7 (T7Pol).Construimos además dos plásmido derivados del pSag, denominados pSagGFP ypSagCherry, que contienen el gen de la proteína fluorescente GFP o mCherry enremplazo del gen GPC o NP, respectivamente. También se generó un plásmidocontrol, pLag_pol(-), que contiene dos cambios puntuales en el ORF de L queinhiben su actividad polimerasa.Para evaluar estas construcciones se emplearon células BHK-T7, que expresan laT7Pol en forma constitutiva. Las células fueron transfectadas con distintascantidades de los plásmidos pSag GFP o pSagCherry junto con pLagWT. Se evaluóparalelamente el efecto de la adición a la mezcla de transfección de losplásmidos pNP y/o pL, que expresan las proteínas NP y L, respectivamente. Losresultados mostraron la acumulación de la correspondiente proteína fluorescente(GFP o mCherry) en las células cotransfectadas con pLagWT. Además, la adiciónde pL resultó en un incremento de la señal fluorescente. En contraste, como seesperaba, no se detectó fluorescencia en las células cotransfectadas conpLag_pol(-). Estos resultados indicaron que el ARN transcripto a partir de losplásmidos pSagGFP o pSagCherry fue efectivamente transcripto y replicado. Conel fin de obtener virus infeccioso, células BHK-T7 fueron transfectadas con lascantidades y proporciones óptimas de los plásmidos pSag, pLagWT y pLdeterminadas previamente. La titulación de los sobrenadantes celularescolectados luego de 72 hs de incubación, indicó la presencia de 102pfu/ml de TCRV infeccioso. Luego de 4 pasajes de los sobrenadantes en célulasBHK, se logró amplificar el stock viral obteniéndose un titulo de 106PFU/ml. La generación de TCRV recombinante constituye una valiosa herramientapara el estudio de diversos aspectos de la biología de los arenavirus a nivelmolecular, en el contexto de una autentica infección.