INVESTIGADORES
MARTINEZ CALEJMAN Camila
congresos y reuniones científicas
Título:
Esteatohepatitis inducida por una dieta rica sacarosa: ¿un cambio en el hábito dietario es suficiente para la reversión?
Autor/es:
WISZNIEWSKI, MORENA; CALDARERI, L.; MARTINEZ CALEJMAN C; CYMERYNG C. B.; ESTEBAN MARTIN REPETTO
Lugar:
Rosario
Reunión:
Congreso; Reunion Anual de la Sociedad Argentina de Diabetes; 2022
Institución organizadora:
Sociedad Argentina de Diabetes
Resumen:
Introducción:En los últimos años, la morbilidad y mortalidad asociada a enfermedades no transmisibles haaumentado a nivel global. Dentro de estas, la prevalencia de la enfermedad hepática grasa noalcohólica (EHGNA), asociada disfunción metabólica como la obesidad y diabetes se encuentradentro de proporciones epidémicas (se estima en alrededor del 25% mundial, y dentro de lapoblación con diabetes tipo 2, en el 55%[1][2]).Es evidente que el EHGNA, generalmente percibido como una condición benigna, puede tener unefecto deletéreo importante en pacientes diabéticos, incrementando el riesgo de desarrollarcomplicaciones cardiovasculares, pero también de enfermedades hepáticas más serias,entendiéndose como una condición multisistémica[3,4]. En nuestro país, según la 4ta EncuestaNacional de Factores de Riesgo del año 2018, la prevalencia de diabetes aumentó de 9,8% a 12,7%entre el año 2013 y 2018, en concordancia con el crecimiento de la obesidad[5].El estilo de vida y los hábitos dietarios pueden contribuir tanto positiva como negativamente en elestablecimiento y progresión de EHGNA. Globalmente, los hábitos alimenticios han cambiadodrásticamente con un aumento en el consumo de dietas ricas en ácidos grasos saturados ycarbohidratos, tanto en comidas como bebidas[6]. Más que nada, se ha visto que el consumo debebidas ricas en sacarosa (gaseosas, jugos industriales, bebidas deportivas, bebidas energéticas) haaumentado de forma paralela al aumento de la obesidad y diabetes tipo 2[7–9]. La Argentina seencuentra dentro de los países latinoamericanos con mayor consumo de sacarosa de acuerdo con elEstudio Latinoamericano de Nutrición y Salud (ELANS)[10].EHGNA comprende un amplio espectro de alteraciones histológicas que van desde una simpleesteatosis (infiltración grasa en más del 5% de los hepatocitos) a esteatohepatitis no alcohólica(EHNA). Morfológicamente, EHNA se encuentra caracterizado por la presencia de esteatosis,balonización de hepatocitos e inflamación, con o sin fibrosis. En este estadio, la enfermedad puederevertir hacia un paso previo, o evolucionar a cirrosis y en algunos casos, hepatocarcinoma y fallahepática [11,12] Aunque la etiología es desconocida, se ha propuesto un modelo de múltiples golpesparalelos al hígado, que incluyen la inducción del estrés de retículo,[13] la generación de estrésoxidativo [14]y a las citoquinas proinflamatorias como las principales responsables en la progresión deEHGNA a EHNA[15–17].Resultados previos de nuestro laboratorio han demostrado que la administración de una dieta rica ensacarosa (sacarosa al 30% p/v en agua de bebida) a ratas Wistar macho, es capaz de generar unestado de insulino resistencia sistémica y un cuadro compatible con síndrome metabólico[18]. Es elobjetivo de este trabajo evaluar si esta dieta también se asocia al desarrollo de EHGNA y evaluar loscambios asociados con el retorno a la dieta control.Materiales y métodos:Diseño del estudioRatas Wistar macho adultas (entre 200 y 250g) fueron obtenidas del bioterio central de la Facultadde Farmacia y Bioquímica, Universidad de Buenos Aires. Los animales se alojaron en jaulas engrupos y se mantuvieron en condiciones ambientales controladas de temperatura y humedad (21 ± 2°C, 40-70% de humedad relativa), bajo un ciclo de luz oscuridad de 12/12h. Luego de un período deadaptación de una semana se iniciaron los siguientes protocolos experimentales:Protocolo 1: Las ratas fueron alimentadas con alimento balanceado estándar y agua de la canilla(grupo control o C) o con una solución al 30% p/v de sacarosa en el agua de bebida (grupo dieta ricaen sacarosa o DRS) ad libitum por 12 semanas. Protocolo 2: Las ratas fueron sometidas al protocolo1 hasta la semana 10, semana en la cual un subgrupo de los animales DRS se las subdividió en 2grupos: uno de ellos continuó recibiendo la DRS, mientras que el otro subgrupo continuó hasta elfinal de las 12 semanas consumiendo agua ad libitum (grupo DRS reversión o DRS-Rev). En todoslos casos, se calculó el consumo calórico cada 48h y se controló el peso corporal una vez porsemana.Los protocolos y procedimientos experimentales del presente trabajo fueron aprobados por laComisión Institucional para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio (CICUAL, Facultad deMedicina, Universidad de Buenos Aires).Metodología empleada para la obtención de resultados:I. Test de tolerancia a la insulina y test de tolerancia al piruvato:Durante la semana 10 y 12 de tratamiento, los animales fueron ayunados por 4 horas previo a laadministración de 1UI/Kg de insulina humana (Insuman, Sanofi, Gentilly-Francia) y se sacó sangrepor la vena de la cola cada 5 minutos, por 25 minutos. La pendiente de la de la curva de laconcentración de glucosa en función del tiempo (kTTI). Para la prueba de tolerancia al piruvato, losanimales fueron ayunados por 6 horas antes de la administración de 1g/kg de piruvato de sodio (pH7.4 en NaCl 0.9%, Sigma Aldrich, St Louis, MO, USA). Sangre de la cola se obtuvo en los tiempos 0,15, 30 60 y 120 minutos post inyección para evaluar los niveles de glucosa en los diferentes tiempos.Se calculó el área debajo de la curva (ADC). En ambos casos, los niveles de glucosa sedeterminaron con un método colorimétrico basado en la reacción GOD/POD (Wiener Lab, Rosario,Argentina).II. Muestras de suero y tejido hepáticoAl finalizar el período experimental, los animales fueron sacrificados y se recolectó sangre a partir dela arteria troncal. Se obtuvo suero, el cual fue congelado a -70°C inmediatamente, al igual que lostejidos recolectados.III. Parámetros bioquímicos sistémicosParámetros séricos como la glucosa, triglicéridos, NEFAs, urea, creatinina, albúmina, proteínastotales y la actividad de enzimas hepáticas como: ALT, AST, LDH, FAL, y CHE) fueron medidasempleando un autoanalizador Siemens ADVIA 1650 de acuerdo con las instrucciones del fabricante(Siemens, Alemania).IV. Determinación de contenido de triglicéridos hepáticosEl contenido lipídico del hígado fue determinado de acuerdo con procedimientos ya publicados conmodificaciones. [19] Brevemente, 50mg de tejido fue homogeneizado en 1mL de isopropanol. Loshomogenatos fueron centrifugados a 2000g por 10 minutos. 30μL del sobrenadante fue evaporado yel residuo sólido resuspendido en 10μL de PBS 1x. el contenido de triglicéridos fue evaluado con unkit comercial utilizando un método colorimétrico de acuerdo con las instrucciones del fabricante.(Wiener Lab, Rosario, Argentina).V. Parámetros de estrés oxidativo y actividad de enzimas antioxidantesEl tejido hepático fue homogeneizado en 500μL 15mM KH2PO4/K2PO4 60 mM KCl pH 7,4. Loshomogenatos fueron centrifugados a 1000g por 10 minutos. Se realizó a partir del sobrenadante ladeterminación de lipoperóxidos mediante la técnica de TBARS de acuerdo con procedimientos yapublicados[20]. La actividad de superóxido dismutasa (SOD) y catalasa fue medida procedimientos yapublicados[20,21].VI. Análisis histológico e inmunofluorescenciaPara analizar las modificaciones histológicas, fragmentos hepáticos fueron fijados en una solución deformol 10% toda la noche. Luego, el tejido fue deshidratado, se aclara con xileno y luego se embebióen parafina. Secciones longitudinales de 5μm se cortaron empleando un micrótomo (Leica, LeicaMicrosystems, Buenos Aires, Argentina). Para el análisis histológico, los cortes se tiñeron conhematoxilina y eosina (H&E) y fueron evaluados por un patólogo ciego a los tratamientos, el cualgraduó las muestras de acuerdo con un Score de daño histopatológico (NAS Score).Para visualizar el contenido de grasas, se realizó una tinción de Oil Red O. Para ello, fragmentoshepáticos fueron fijados en formol-calcio al 10%, tras pasajes de concentraciones crecientes ensacarosa, los tejidos fueron embebidos en Tissue-Tek OCT (Sakura Finetek, Japón), y fueroncortados en secciones longitudinales de 8μm empleando un crióstato (Leica, Leica Microsystems,Buenos Aires, Argentina). Se realizó la tinción de Oil Red O según las indicaciones del fabricante(Biopack, Buenos Aires, Argentina). En ambos casos, las imágenes fueron capturadas con unmicroscopio óptico (Eclipse E400, Nikon, Tokio, Japón), utilizando una lámpara halógena de 6-V(20W; equipada con una fuente de luz estabilizada), y una cámara (Coolpix s10, Nikon, Abingdon,VA, USA). Para realizar el análisis cuantitativo de la tinción de Oil Red O, se emplearon 6 animales y6 campos al azar por vidrio, por tratamiento en una magnificación de 20x. El área total de pixelesrojos en los tejidos teñidos con Oil Red fue determinado utilizando el software ImageJ (Versión 1.53U.S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA). Los datos se expresan como media ±DEM del porcentaje de señal con respecto a las muestras controles.Las inmunofluorescencias fueron realizadas en secciones de crióstato. Brevemente, se realizó lapermeabilización del tejido incubando a los tejidos con tritón X-100 0.1% en PBS 1x. luego de treslavados con PBS, los tejidos fueron incubados por 1 hora en una solución de bloqueo (Suero FetalBovino 2%), y luego toda la noche en una cámara húmeda con anticuerpos primarios: anti-3-nitrotirosina 1:50 (NO2Tyr, CAT# MAB3248, R&D) o anti carboximetil-lisina (CML, CAT# MAB 3247,R&D) en solución de bloqueo. Luego de realizar varios lavados, los vidrios se incubaron por 2 horasa temperatura ambiente con anticuerpos secundarios conjugados con un fluoróforo (Cy3- goat anti-mouse 1:500, Cat# 115-165-003, Jackson Immuno Research). Luego de varios lavados, lassecciones fueron montadas con un medio con DAPI (Vectashield, Vector Laboratories, USA). Lasimágenes fueron capturadas en un microscopio de fluorescencia (BX‐50 Olympus, USA) a través deuna cámara digital acoplada (3CCD, Sony, USA). Imágenes comparativas de diferentes muestras seobtuvieron utilizando condiciones idénticas de captura: exposición, brillo y contraste. La intensidad defluorescencia fue cuantificada empleando ImageJ.VII. Aislamiento de ARN y PCR en tiempo real (qPCR):ARN total fue obtenido de 50mg de tejido utilizando el reactivo de Quickzol® de acuerdo con lasinstrucciones del fabricante (Kalium Technologies, Buenos Aires, Argentina). Transcripción reversase realizó empleando la transcriptasa reversa MMLV (Life Technologies, Argentina).Las reacciones de qPCR fueron realizadas en Rotor‐Gene 6000 Corbett Life Science Real TimeThermal Cycler (Corbett Research, Sidney, NSW, Australia) y cuantificadas con el software de RotorGene 6000 (versión 1.7 Build 40, Hilden, Germany). La expresión génica fue normalizada a actina,como un control interno, utilizando el método de cuantificación relativa ΔΔCT con la eficienciacorregida.VIII. Western blotLos hígados fueron homogeneizados en buffer RIPA y 80μg de proteínas fueron calentadas a 95°Cen buffer muestra para luego ser cargadas en geles de 10 ó 12%. Luego de la electroforesis, lasproteínas fueron transferidas a una membrana de PVDF por 30 minutos a 15 voltios en un sistemade transferencia semi-seco (Trans-Blot SD, Bio-Rad, California, USA). Las membranas una veztransferidas fueron bloqueadas con leche descremada al 5% en TTBS por 1 hora, y luego incubadascon el anticuerpo primario correspondiente a 4°C toda la noche. Luego de varios lavados, lasmembranas fueron incubadas con el anticuerpo secundario adecuado. Bandas específicas fueronvisualizadas por quimioluminiscencia, y las imágenes se obtuvieron empleando GeneGenome XRQ(Bangalore, India). La intensidad de las bandas quimioluminiscentes fue cuantificada empleando elsoftware FluorChem (Protein Simple, San José, California, USA)IX. Análisis estadísticoSe analizó la distribución de todos los valores obtenidos mediante la prueba de Shapiro-Wilk.Cuando los datos se distribuían de forma paramétrica, los resultados se presentan como media ± elerror estándar de la media. En caso contrario, se presentan como mediana y rango.Cuando se trabajó con dos grupos experimerimentales las diferencias significativas fueron evaluadasmediante test t de Student ó test de Wilcoxon Mann Whitney, de acuerdo con su distribución. Enambos casos, se tomó como significativa aquellas diferencias donde p< 0,05.Las diferencias entre los grupos fueron analizadas por ANOVA de una vía o Kruskal wallis, según ladistribución de los datos. Cuando se obtuvo una diferencia significativa en el ANOVA (p< 0,05), serealizó una comparación post test (se realizó la prueba de Tukey o Dunn) para determinar ladiferencia significativa entre los grupos. Todos los datos fueron analizados utilizando GraphPadPrism 8 para Windows (GraphPad Software, CA, USA).Resultados:Efectos sistémicos y hepáticos de una DRS por 12 semanasEn nuestro modelo hemos descripto que la administración de una dieta rica en sacarosa se asoció aldesarrollo de insulinorresistencia a partir de la semana 7 de dieta [18] y se mantiene hasta el final deltratamiento (p