Desarrollo de un fragmento de anticuerpo recombinante de cadena única (scFv) para la optimización del proceso de purificación de la hormona folículo estimulante humana recombinante (rhFSH)

AGUILAR, MF; FORNO, G; KRATJE, R; ETCHEVERRIGARAY, M; OGGERO, M; ATTALLAH, C

Buenos Aires

Jornada; XII JorFyBi; 2015

INTRODUCCIÓNLa hormona folículo estimulancte humana (hFSH) juega un rol importante en la regulación y mantenimiento de los procesos reproductivos. Cuando se encuentra en bajas concentraciones, debido a una disminución en su síntesis o secreción, genera problemas de infertilidad, que pueden ser revertidos mediante la administración terapéutica de hFSH.Actualmente, se produce hFSH recombinante (rhFSH) a partir de células CHO (del inglés, Chinese Hamster Ovary), y su purificación se realiza mediante cromatografía de inmunoafinidad, utilizando anticuerpos monoclonales (mAbs) anti-rhFSH como ligandos bioespecíficos inmovilizados en una matriz. Con este fin, en nuestro laboratorio se han generado hibridomas productores de mAbs anti-rhFSH. Sin embargo, la preparación de estos mAbs en cantidad necesaria para purificar la hormona con fines terapéuticos, resulta dificultosa, costosa, demanda mucho tiempo e implica el cultivo de células en presencia de suplementos de origen bovino. Una alternativa para salvar estos obstáculos es la obtención de un fragmento variable de anticuerpo de cadena única (scFv) (del inglés, single-chain variable fragment), formado por la unión covalente de las regiones variables de la cadena pesada (VH) y liviana (VL) del correspondiente mAb, mediante un péptido linker, y expresado como una única cadena proteica en bacterias. Generalmente, este scFv presenta una afinidad similar al anticuerpo original y posee la capacidad de conferir al proceso ventajas tecnológicas y operativas, tales como: la facilidad en su producción (ya que puede ser expresado en células procariotas), menor costo y tiempo del proceso, y la eliminación del uso de productos de origen animal lo que se traduce en un aumento del perfil de seguridad viral del producto final. Asimismo, es posible obtener rendimientos similares, o superiores, a los alcanzados mediante la producción habitual de mAbs. Por lo tanto, el objetivo general de este trabajo consiste en la obtención de un scFv, a partir de un hibridoma murino productor de un mAb anti-rhFSH, con la finalidad de optimizar el proceso productivo de esta hormona terapéutica recombinante.METODOLOGÍAEl scFv P1E4 anti-rhFSH fue construido mediante el empalme de las secuencias nucleotídicas de los fragmentos VH y VL correspondientes al mAb P1E4, empleando un péptido linker. Dicho empalme fue realizado mediante SOE-PCR (del inglés, splicing by overlap extension polymerase chain reaction) utilizando para ello pares de oligonucleótidos especialmente diseñados. Previamente, se generó una biblioteca de secuencias VH y VL, a partir del ARN total extraído del hibridoma productor del mAb P1E4, y se identificaron las secuencias correspondientes mediante secuenciación y análisis bioinfomático. Por otro lado, la secuencia del linker se obtuvo a partir de un scFv anti-rhIFN-alpha2b generado con anterioridad en nuestro laboratorio. El análisis bioinformático incluyó la agrupación de las secuencias según su homología, con el programa Vector NTI Advance® ContigExpress®, una búsqueda de proteínas homólogas a las secuencias traducidas (BLASTX), la selección de aquellas secuencias que presentaron identidad con regiones variables de inmunoglobulinas de ratón y, finalmente, la identificación de las 3 regiones determinantes de la complementariedad (CDR) en las secuencias seleccionadas. El fragmento scFv fue clonado en el vector de expresión pET22b (Novagen), el cual permite la expresión de la proteína de interés en el espacio periplásmico de las células, fusionada a una etiqueta de 6 residuos de histidina en el extremo C-terminal de la misma. De esta forma, la expresión del scFv se llevó a cabo en células E. coli BL21(DE3) y BL21(DE3) Rosetta, en presencia y ausencia de agente inductor (IPTG 1mM). La extracción del scFv se realizó mediante shock osmótico, a partir del cual se obtuvieron las fracciones periplásmica (EP) y citoplasmática (EC). Ambas fracciones fueron analizadas para evaluar la expresión y la capacidad de unir al antígeno (rhFSH) mediante ensayos de Western blot (WB) y ELISA, respectivamente. Junto con el fragmento P1E4 se realizó la expresión de un scFv-HisTag anti-rhIFN-alpha2b (CA5E6), desarrollado en el laboratorio, para utilizar como control positivo en dichos ensayos de inmunodetección.RESULTADOSEn primera instancia, se generó una biblioteca de más de 150 clones correspondientes a los distintos fragmentos VH y VL, de los cuales, se seleccionaron 64 correspondientes a VH y 29 a VL, para su análisis por secuenciación. Mediante análisis bioinformático de las secuencias obtenidas, se obtuvieron 2 secuencias consenso VH (VH016 y VH058) y 2 VL (VL088 y VL101). Sin embargo, sólo se logró identificar los 3 CDRs en las secuencias VH016 y VL088. Las restantes secuencias se identificaron como transcriptos aberrantes. El resultado arrojado por el ensayo de Wb indicó que los mejores niveles de expresión del scFv se obtuvieron en los casos de la cepa BL21(DE3) con el agregado de IPTG y la cepa Rosetta(DE3) en ausencia del inductor, por lo cual se decidió continuar trabajando bajo esta última condición. Por otro lado, se evidenció la presencia de proteína funcional tanto en el extracto periplásmico como en el citoplasmático, sin embargo al no conocer la masa de anticuerpo funcional presente en este último, ni su estabilidad, se decidió trabajar con la fracción periplásmica. Mediante un ELISA específico indirecto se corroboró la capacidad del scFv P1E4 de reconocer en forma específica a la rhFSH inmovilizada en fase sólida. Al mismo tiempo, la técnica de ELISA de competición permitió evaluar la capacidad de interacción del scFv P1E4 con su antígeno en comparación con el mAb original. El resultado arrojado por este ensayo, confirmó la identidad del paratope del fragmento scFv P1E4 con respecto al mAb original. Finalmente, se evaluó la capacidad de reconocimiento de la hormona en forma soluble por parte del fragmento scFv P1E4 mediante un ensayo de ELISA sándwich indirecto. A partir de los valores de absorbancia en función de las diluciones de la muestra, se pudo comprobar la capacidad del scFv de unir la rhFSH en forma soluble. CONCLUSIONESLos resultados obtenidos en el transcurso de este trabajo nos permiten postular al fragmento de anticuerpo scFv P1E4, como ligando bioespecífico en procesos cromatográficos para purificar la hormona terapéutica rhFSH. Como perspectiva de trabajo, se pretende purificar el scFv P1E4 mediante cromatografía de afinidad a iones metálicos inmovilizados (IMAC), determinar la constante de afinidad de este fragmento recombinante, comparándola con la del mAb original, y evaluar su desempeño como ligando en una cromatografía de inmunoafinidad para la purificación de la hormona rhFSH.