OPTIMIZACIÓN DEL PROCESO DE GENERACIÓN DE LÍNEAS Y CLONES CELULARES PRODUCTORES DE rhFVIII

GUGLIOTTA, AGUSTINA; BÜRGI, MARÍA DE LOS MILAGROS; ATTALLAH, CAROLINA; MUFARREGE, EDUARDO; FONTANA, DIEGO; ANTUÑA, SEBASTIÁN; RAIMONDI, ALEJANDRO; TARDIVO, MARÍA BELÉN; ETCHEVERRIGARAY, MARINA; KRATJE, RICARDO; PRIETO, CLAUDIO

La Plata

Simposio; 2do Simposio Argentino de Procesos Biotecnológicos; 2012

UNLP - CINDEFI

Introducción El factor de coagulación VIII (FVIII) es una glicoproteína compleja de alto peso molecular compuesta por dos cadenas de polipéptidos: la cadena liviana de 80 kDa y la cadena pesada de 90 kDa. Ambas derivan de un péptido simple cadena (170 kDa) que conforma dicho heterodímero. El FVIII participa en la cascada de coagulación de la sangre, como co-factor del factor IXa, en la activación del factor X. La producción deficiente de FVIII funcional resulta en un trastorno hemorrágico grave ligado al cromosoma X, conocido como hemofilia A. Este desorden hematológico afecta a uno de cada cinco mil hombres y se manifiesta con episodios de sangrado espontáneos. Inicialmente, el tratamiento de la hemofilia A se realizaba empleando  FVIII purificado a partir de plasma humano como agente terapéutico. Sin embargo, la presencia de contaminantes potencialmente peligrosos para los pacientes en tratamiento, condujo al desarrollo y producción del FVIII humano recombinante (rhFVIII). Las células animales constituyen el huésped de elección para la producción de esta glicoproteína compleja, debido a la importancia de sus modificaciones post-traduccionales. Sin embrago, el empleo de células animales se caracteriza por presentar condiciones de cultivo muy específicas, demandas de nutrientes exigentes y baja productividad de la proteína de interés, con respecto a los sistemas bacterianos. Además, teniendo en cuenta que el rendimiento de rhFVIII a partir del cultivo de células CHO es de 2 o 3 órdenes de magnitud menor comparado con otras proteínas de tamaño similar, resulta de gran interés desarrollar metodologías que permitan obtener clones celulares con elevada expresión. Es por esto que, se han desarrollado en nuestro laboratorio líneas y clones celulares con elevada productividad. Se emplearon vectores lentivirales de tercera generación como sistemas de transferencia de material genético, los cuales son capaces de transducir células tanto en fase de división como de no-división, y sostener la expresión del transgen durante períodos prolongados de tiempo. Además, se evaluó la incidencia del número de células a transducir y el número de eventos de transducción.   Metodología Inicialmente, se llevó a cabo la construcción de los vectores lentivirales pLV‑EF1α‑FVIII y pLV-CMV-FVIII conteniendo ambos la secuencia codificante para hFVIII optimizada para su expresión en células CHO.K1. Uno de los vectores posee el promotor celular EF1α y el otro vector posee el promotor de citomegalovirus (CMV). Posteriormente, se realizó el ensamblado de partículas lentivirales mediante transfección de células empaquetadoras HEK293T empleando tres vectores plasmídicos (pMDL, pREV y pVSVG) y un vector de transferencia conteniendo la secuencia codificante para el FVIII (pLV-EF1α-FVIII o pLV‑CMV‑FVIII). Los vectores plasmídicos lentivirales empleados poseen secuencias que codifican para proteínas que cumplen funciones estructurales y que participan en el proceso de replicación del lentivirus. Para la optimización del ensayo de transducción de células CHO.K1 se evaluó la densidad celular óptima a emplear durante el protocolo de transducción (60.000 o 200.000 cél/ml), así como los efectos de realizar 1 o 2 eventos de transducción en forma consecutiva, utilizando para tal fin 1.105 UT/ml de cada vector lentiviral. Las líneas celulares seleccionadas fueron clonadas por el método de dilución límite, empleando 4 placas de 96 pozos. Los diferentes screenings permitieron seleccionar tres clones productores, los cuales fueron caracterizados mediante ensayos de ELISA sándwich y western blot. Los anticuerpos mono y policlonales empleados en los ensayos mencionados fueron desarrollados en nuestro laboratorio.   Resultados La optimización del proceso de generación de líneas celulares con el vector pLV‑EF1α‑FVIII permitió definir que la densidad celular óptima a transducir es de 60.000 cél/ml, realizando dos eventos de transducción sucesivos. De este modo, se obtuvo la línea celular CHO‑EF1α-FVIII, cuya productividad específica de rhFVIII fue de 390,4 ng.10-6cél-1.día-1. Este valor fue superior al evidenciado por la línea celular CHO‑CMV‑FVIII, el cual fue de 287 ng.10-6cél-1.día-1. Luego del clonado de la línea celular CHO‑EF1α‑FVIII se realizó el screening de 174 clones, de los cuales 28% presentó una producción superior a la de la línea celular de origen. Posteriormente, se seleccionaron los clones P3H9, P2H9 y P1C12 para su caracterización, siendo P3H9 el mejor clon productor de los tres evaluados, ya que mostró una productividad específica de 3.064 ng.10‑6cél-1.día-1. Por otro lado, para el caso de la línea celular CHO‑CMV‑FVIII se evaluaron 41 clones, siendo 27% de ellos capaces de expresar concentraciones de rhFVIII superiores al valor producido por la línea celular de la cual provienen. En este caso se seleccionó únicamente al clon P5B2 que, luego de su evaluación, demostró ser capaz de producir  1.100 ng.10-6cél-1.día-1. Además, para todos los clones caracterizados, se pudo verificar la identidad de la simple cadena, así como de las cadenas pesada y liviana del rhFVIII expresado, con respecto a la proteína comercial.   Conclusiones Se desarrolló un proceso de generación de líneas celulares productoras de rhFVIII, estableciendo las condiciones para su obtención: el número de células a transducir y los eventos de transducción necesarios. También se evaluó el empleo de dos promotores con características diferentes, definiendo así la importancia del empleo del promotor EF1α. De esta manera, obtuvimos un clon con elevada productividad específica, aproximadamente 8 veces superior a la evidenciada por la línea celular de la cual proviene (CHO-EF1α-FVIII). Teniendo en cuenta la baja estabilidad del rhFVIII en cultivo, así como la dificultad que presenta producir esta proteína recombinante en células animales, podemos decir que los resultados aquí alcanzados son de gran interés para la industria farmacéutica. Además, su identidad con respecto a la proteína recombinante comercial, permite postular al clon P3H9 para la producción de rhFVIII a escala industrial. El rhFVIII producido en nuestro laboratorio mediante la aplicación de protocolos optimizados, constituye un potencial agente terapéutico para el tratamiento de pacientes con hemofilia A y podría presentarse como un producto altamente competitivo en el mercado.