GENERACIÓN DE LÍNEAS CELULARES ESTABLES PRODUCTORAS DE rhFVIII MEDIANTE EL USO DE VECTORES LENTIVIRALES COMO SISTEMA DE TRANSFERENCIA DE MATERIAL GENÉTICO

ATTALLAH, C.; GUGLIOTTA, A.; FONTANA, D.; MUFARREGE, E.; ANTUÑA, S.; RAIMONDI, A.; BÜRGI, M.; TARDIVO, M.; ECHEVERRIGARAY, M.; KRATJE, R.; PRIETO, C.

Buenos Aires

Jornada; XI JorFyBI; 2011

Sociedad Argentina de Farmacia y Bioquímica Industrial

Introducción: La producción de proteínas recombinantes de alto peso molecular es uno de los principales desafíos de las industrias biofarmacéuticas. Como ejemplo se destaca la producción del Factor VIII de coagulación humano recombinante (rhFVIII), utilizado para el tratamiento de la hemofilia A. Esta enfermedad genética hereditaria es causada por la reducción de la cantidad y/o actividad de FVIII. Este desorden hematológico se manifiesta con episodios de sangrado espontáneos y su severidad se correlaciona con el nivel de actividad residual de este factor de coagulación. El tratamiento involucra infusiones intravenosas crónicas de productos conteniendo FVIII derivado de origen humano o recombinante. El rendimiento de rhFVIII a partir del cultivo de células CHO es de 2 o 3 órdenes de magnitud menor comparado con otras proteínas de tamaño similar, lo cual determina una clara dificultad para su producción y la necesidad de su optimización mediante nuevas estrategias. Con ese fin, hemos desarrollado líneas y clones celulares productores de rhFVIII utilizando vectores lentivirales de tercera generación como sistemas de transferencia de material genético. Estos vectores son capaces de transducir células tanto en fase de división como de no-división y sostener la expresión del transgen durante períodos prolongados.   Materiales y Métodos: La generación de las líneas celulares (F8TdA y F8TdB) fue realizada mediante transducción y re-transducción de células CHO-K1 con vectores lentivirales (LV-FVIII), respectivamente. A partir de la línea F8TdA se seleccionaron 45 clones y se analizaron comparativamente sus productividades por ELISA. Se seleccionó el clon F8A-P5B2 y se re-transdujo con LV-FVIII generando así la línea F8TdB. A partir de esta última, se seleccionaron 125 clones y se analizó comparativamente sus productividades, como en el caso anterior. Cada una de las líneas celulares fue sometida a un proceso de presión selectiva con concentraciones crecientes de puromicina en medio de cultivo DMEM/Ham-F12 conteniendo 5% SFB, con el propósito de seleccionar células con mayor nivel de expresión. Los clonados fueron realizados por el método de dilución límite. Los sobrenadantes de las líneas celulares y clones obtenidos fueron evaluados mediante un ensayo de ELISA sandwich, utilizando anticuerpos mono- y policlonales desarrollados en nuestro laboratorio (1º anticuerpo: mAb P9E10-P2E5, 2º anticuerpo: Suero Conejo 2º Sangrado 2º Exudado).   Resultados: El análisis comparativo de productividad de los 45 clones seleccionados, en la primera etapa, a partir de la línea F8TdA indica que el 22% de los mismos producen más que la línea. Uno de ellos fue seleccionado (F8A-P5B2 = 870 ng/ml.d.106 cél.), ya que triplica la productividad de la línea de origen (Tabla 1). Además, el estudio de la línea re-transducida (F8TdB) demuestra que, de los 125 clones seleccionados, el 81% supera el valor de la línea F8TdB (Fig. 1). Asimismo, el 50% de ellos produce entre 5 y 7 veces más (1.435 – 2.142 ng/ml.d.106 cél.) que la línea F8TdA (Fig. 2).   Conclusiones: Los resultados obtenidos demostraron que mediante la re-transducción de un clon productor de rhFVIII fue posible incrementar considerablemente su productividad específica (hasta 7 veces). Paralelamente, esta metodología posibilitó la obtención de un mayor número de clones que superaron los valores de productividad específica con respecto a la línea original, aumentando significativamente el rendimiento del proceso de obtención de clones con características productivas mejoradas. Teniendo en cuenta la corta vida media de esta proteína en el cultivo (2,5 horas), este incremento resulta especialmente importante para el éxito de su proceso de producción.