Función biológica de la histona H2B.Z de Toxoplasma gondii

MUÑOZ, DANIELA; AGUSTINA GANUZA; ANGEL S.O.; LAURA VANAGAS

Resistencia

Congreso; XXX Reunión Científica Anual, Sociedad Argentina de Protozoología (SAP); 2018

SAP

Toxoplasma gondii es un parásito intracelularobligado dehumanos y animales, perteneciente al Phylum Apicomplexa. Los moduladoresepigenéticos y la alteración de la estructura de la cromatina son muyimportantes en la regulación de la expresión génica, lareplicación y el mecanismo de reparación del ADN. Las histonas canónicas yvariantes son componentes principales de la cromatina. H2B.Z es una histonavariante única de Apicomplexa que conforma nucleosomascon H2A.Z en T.gondii, posicionándose mayormente en promotores de genes transcripcionalmenteactivos. Ambas histonas son modificadas post-traduccionalmente y nuestrahipótesis es que esta regulación epigenética es fundamental para el pasaje deestadio taquizoito a bradizoito. Para determinar la importancia biológica de H2B.Zy de sus acetilaciones N-terminales obtuvimos parásitos que sobre-expresan lahistona salvaje (c-Myc-WT) o mutantes: con las 5 lisinas acetilables mutadas yasea por alaninas (c-Myc-A) (aminoácido neutro) o por argininas (c-Myc-R)(aminoácido con carga positiva), todas ellas etiquetadas con c-Myc. Losparásitos no mostraron diferencias significativas en su tasa de replicación,pero observamos un aumento de la tasa de diferenciación para la mutante c-Myc-Rcomparada con el parental, y una disminución de la misma en la mutante c-Myc-A.Dado que H2B.Z es esencial para la sobrevida del parásito, decidimos realizarla disrupción génica del gen endógeno mediante el sistema CRISPR/CAS9, en losparásitos que sobre-expresan las histonas mutadas. Para esto, se diseñaronsgRNAs de 20-40 nucleótidos del marco de lectura abierto del gen H2B.Z de laregión N-terminal. Se co-transfectaron los parásitos con el vector y unamplicón portando el cassette de selección de DHFR + regiones de homología conel 3´y 5´UTR de la histona endógena para inserción disruptiva por doblerecombinación homóloga. La eficiencia de la transfección fue analizada porInmunofluorescencia Indirecta. Se seleccionaron los parásitos con pirimetaminay luego de 3 pasajes se clonaron por dilución límite. Los clones fueronanalizados por PCR y Western Blot, además de enviarse a secuenciar. Los ensayosfenotípicos preliminares muestran un aumento en la tasa de diferenciación paralos parásitos c-Myc-R, cuya histona endógena fue delecionada. En conclusión,las acetilaciones en el N-terminal de la histona H2B.Z tendrían una funciónimportante en el proceso de diferenciación del parásito.