INVESTIGADORES
GIMENEZ Guadalupe
congresos y reuniones científicas
Título:
CLONADO Y EXPRESIÓN DE FOSFOLIPASA A1 DE LEISHMANIA BRAZILIENSIS EN UN SISTEMA DE EXPRESIÓN DE BACULOVIRUS
Autor/es:
BOTT E; LOPEZ MG; GIMENEZ G; LAMMEL EM; ISOLA ELD; TABOGA O; BELAUNZARÁN ML
Reunión:
Otro; XXVII Reunión Anual de la Sociedad Argentina de Protozoología; 2015
Resumen:
Resultados de nuestro laboratorio sugieren un papel fisiológico importante para las fosfolipasas A1 (PLA1) de tripanosomátidos, particularmente en los estadios del mamífero, que podría contribuir a la patogénesis de las enfermedades causadas por estos patógenos. En Leishmania braziliensis detectamos previamente la presencia de actividad PLA1, realizando luego la búsqueda de genes putativos en TriTrypDB y seleccionando el gen LbrM.31.2750 para su clonado y expresión en E. coli. La proteína recombinante obtenida fue reconocida por suero anti-PLA1 pero no presentó actividad enzimática (Belaunzarán y col. 2011). En el presente trabajo clonamos y expresamos dicho gen en el sistema baculovirus-células de insecto Bac-to bac. La secuencia codificante para PLA1 se amplificó por PCR desde ADN genómico de promastigotes de L. braziliensis obteniendo un producto de 1122 pb que fue clonado en pCR2.1TOPO y sub-clonado en pFastBac HTB®. Los plásmidos que incorporaron el inserto se usaron para transformar bacterias DH10Bac y generar por transposición bácmidos recombinantes con los que se transfectaron células de insecto Sf9. El sobrenadante conteniendo los baculovirus recombinantes se cosechó a los 5 días y luego de 2 pasajes en células se titularon los stocks virales. Se infectaron células Sf9 a una MOI=1 y se cosecharon a las 24, 48 y 72 hs. El análisis por inmunoblot y los ensayos de actividad enzimática de los lisados celulares mostraron que, si bien los niveles de expresión fueron bajos, ésta alcanzó su valor máximo 72 hs post infección. La proteína expresada fue reconocida por el anticuerpo anti-Histidina, con un PM similar al de la enzima nativa de ~50 kDa, siendo capaz de hidrolizar fosfatidilcolina con generación de lisofosfatidilcolina, confirmando así que la misma posee actividad PLA1, la cual fue óptima a pH ~5. La secuencia correspondiente fue depositada en GenBankTM, número de acceso KJ957826. Financiado por Conicet.