Diversidad fúngica de cepas de Aspergillus aisladas de suelo, semillas y compost de nuestro país y su sensibilidad in vitro a azoles de uso clínico

CUESTAS ML

Congreso; 5° Congreso Argentino de Fitopatología 59 TH MEETING OF THE APS Caribbean Division; 2021

Aspergillus flavus constituye la segunda especie de Aspergillus más frecuentemente aislada de pacientes con aspergilosis invasora y no invasora en países tropicales, principalmente en Asia, Medio oriente y África. El tratamiento de primera línea de la aspergilosis se basa en el uso de antifúngicos triazólicos, como itraconazol, voriconazol y posaconazol. Además, los antifúngicos triazólicos constituyen un grupo importante de fungicidas para el control de fitopatógenos fúngicos en la agricultura debido a su eficacia en un amplio espectro de especies. Dichas drogas trizólicas tienen como blanco de acción a las 14-α esterol desmetilasas fúngicas (CYP51), enzimas clave en la vía biosintética del ergosterol, componente fundamental de la membrana celular fúngica. En A. flavus, los CYP51 están codificados por tres genes parálogos: cyp51A, cyp51B y cyp51C. Entre los mecanismos moleculares más frecuentemente descritos en Aspergillus spp. asociados a la resistencia a antifúngicos triazólicos, utilizados tanto en la clínica como en la agricultura, se incluyen las mutaciones puntuales o la sobreexpresión de dichos genes cyp5. Actualmente la emergencia de Aspergillus resistentes a antifúngicos triazólicos es considerada un importante problema de salud pública en todo el mundo. Esto es especialmente alarmante para A. fumigatus, cuyo principal mecanismo de resistencia a triazoles son las mutaciones puntuales en el gen cyp51A y su promotor. Aunque la resistencia adquirida a los triazoles ocurre esporádicamente en los pacientes que reciben tratamientos prolongados con dichos antifúngicos, la principal ruta de adquisición de la resistencia en A. fumigatus la constituye el medio ambiente. En relación a ello, la resistencia a los triazoles de uso clínico está estrechamente relacionada con el uso generalizado de fungicidas azólicos en la agricultura. Actualmente, se conoce poco sobre la presencia de aislamientos de A. flavus resistentes a azoles tanto en el entorno clínico como en el ambiental. Es por ello que el objetivo del presente trabajo fue estudiar la presencia de cepas de A. flavus aislados del ambiente con resistencia cruzada a los antifúngicos triazólicos utilizados en la clínica en nuestro país. Para ello, se estudiaron 18 cepas ambientales de A. flavus aisladas de semillas de garbanzo y soja provenientes de las provincias de Buenos Aires y Salta, las cuales se identificaron a nivel de especie mediante PCR y secuenciación nucleotídica del gen de la calmodulina. Se les analizó el perfil de susceptibilidad a los antifúngicos itraconazol, voriconazol y posaconazol, mediante la determinación de la concentración inhibitoria mínima (CIM) con el método de la microdilución en caldo, de acuerdo al documento M38-A2 del CLSI. A los aislamientos con valores de CIMs elevados a por lo menos uno de los azoles ensayados (CIMs > a los valores de corte epidemiológicos, ECOFF) o aislamientos non-wild type se les analizó la presencia de mutaciones en los genes cyp51A, cyp51B y cyp51C, para conocer uno de los potenciales mecanismos de resistencia a estos azoles. Para ello se amplificaron por PCR dichos genes utilizando cebadores específicos y se los secuenció bidireccionalmente, utilizando el secuenciador ABI BigDye Terminator v.3.1 (Macrogen Inc.). Las secuencias obtenidas fueron alineadas con secuencias salvajes depositadas en el GenBank utilizando el algoritmo Muscle incluido en el programa Unipro UGENE v34.0. Todos los A. flavus aislados del ambiente se identificaron como A. flavus sensu stricto. De ellos, el 33,3% mostró valores de CIMs elevados a por lo menos un antifúngico triazólico. Uno de los aislamientos, mostró valores de CIMs altos para itraconazol (2 µg/ml), cuatro para voriconazol (4 µg/ml) y uno, para ambos antifúngicos (>8 µg/ml en ambos casos). Se observaron mutaciones puntuales en CYP51C, en todos los aislamientos non-wild-type. Sin embargo, algunas de estas mutaciones fueron también encontradas en las cepas wild-type, lo cual está en relación con la naturaleza pleomórfica de este gen. Los parálogos cyp51A y cyp51B no mostraron mutaciones asociadas a resistencia. Cabe destacar la presencia de codones de iniciación alternativos (no AUG) que regulan la expresión del CYP51A en los aislamientos estudiados. Por lo cual, se podría inferir que la síntesis de la proteína CYP51 en A. flavus podría variar entre los diferentes parálogos (CYP51A, B y C) debido a estrés ambiental causado por exposición a fungicidas usados en prácticas agrícolas. Sorprendentemente, observamos que la síntesis de proteínas CYP51B y C generalmente comienza en un codón de inicio definido por un AUG y su contexto de secuencia circundante preferido. Sin embargo, la síntesis de la proteína CYP51A comienza en un codón de inicio que puede ser AUG o ACG y su secuencia Kozak circundante. La importancia cuantitativa de este contexto en los diferentes genes CYP51 es aún poco clara. Sin embargo, estos datos podrían sugerir que el inicio de la traducción sin AUG puede ser un mecanismo adicional para generar isoformas de CYP51A en A. flavus, con el fin de lograr más de una localización intracelular, o un mecanismo adicional que regule la traducción de proteínas ante el estrés que supone, por ejemplo, la exposición a fungicidas en el ambiente. Este último mecanismo podría dar a las células el potencial de provocar respuestas rápidas y reversibles a cambios ambientales repentinos y situaciones de estrés (por ejemplo, en este caso, exposición a altos niveles de fungicidas triazólicos). Este control de traducción juega un papel clave en la determinación de la abundancia de proteínas y la composición del proteoma, y probablemente lograría regular la expresión de proteínas en un ambiente adverso, aunque también podrían actuar otros mecanismos asociados a la resistencia a los antifúngicos como, por ejemplo, la sobreexpresión de los transportadores de eflujo. Como conclusión se documenta por primera vez la presencia de aislamientos ambientales de A. flavus resistentes a azoles de uso clínico, y se detecta la iniciación de la traducción mediante el uso de codones no AUG y variabilidad de las secuencias Kozak en los genes cyp51.