Análisis de la resistencia de aislamientos de Aspergillus flavus aislados de semillas de garbanzo y soja a antifúngicos triazólicos utilizados en la clínica

BRITO DEVOTO T; SAUTUA F; VIDELA GARRIDO A; GARGIULO LB; FENATI LS; PUCA LG; GORDO M; SCANDIANI M; FORMENTO N; LUQUE A; CARMONA M; CUESTAS ML

Jornada; VI Jornadas de Ciencia y Tecnología 2021; 2021

Aspergillus flavus constituye la segunda especie de Aspergillus más frecuentemente aislada de pacientes con aspergilosis invasora (una forma clínica grave de la enfermedad con elevada tasa de mortalidad) y no invasora (ej., aspergilosis pulmonar crónica y la bronquitis). El tratamiento de primera línea de la aspergilosis se basa en el uso de antifúngicos triazólicos, como itraconazol, voriconazol y posaconazol. Los antifúngicos triazólicos constituyen, además, un grupo importante de fungicidas para el control de fitopatógenos fúngicos en la agricultura debido a su eficacia en un amplio espectro de especies. Dichas drogas tienen como blanco de acción a las 14-α esterol desmetilasas fúngicas (CYP51), enzimas clave en la vía biosintética del ergosterol; componente fundamental de la membrana celular fúngica. En A. flavus, los CYP51 están codificados por tres genes parálogos: cyp51A, cyp51B y cyp51C (Zhang et al., 2019). Entre los mecanismos moleculares más frecuentemente descritos en Aspergillus spp. asociados a la resistencia a antifúngicos triazólicos, utilizados tanto en la clínica como en la agricultura, se incluyen las mutaciones puntuales o la sobreexpresión de dichos genes cyp51 (Zakaria et al., 2020). Actualmente la emergencia de Aspergillus resistentes a antifúngicos triazólicos es considerada un importante problema de salud pública en todo el mundo. Esto es especialmente alarmante para A. fumigatus, cuyo principal mecanismo de resistencia a triazoles son las mutaciones puntuales en el gen cyp51A y su promotor (Snelders et al., 2010). Aunque la resistencia adquirida a los triazoles ocurre esporádicamente en los pacientes que reciben tratamientos prolongados con dichos antifúngicos, la principal ruta de adquisición de la resistencia en A. fumigatus la constituye el medio ambiente. En relación a ello, la resistencia a los triazoles de uso clínico está estrechamente relacionada con el uso generalizado de fungicidas azólicos en la agricultura (Berger et al., 2017). Actualmente, se conoce poco sobre la presencia de aislamientos de A. flavus resistentes a azoles tanto en el entorno clínico como en el ambiental. Es por ello que el objetivo del presente trabajo fue estudiar la presencia de cepas de A. flavus aislados de semillas de cultivos locales con resistencia cruzada a los antifúngicos triazólicos utilizados en la clínica en nuestro país.Para ello, se estudiaron 18 cepas de A. flavus aisladas de semillas de garbanzo y soja provenientes de las provincias de Buenos Aires y Salta, las cuales se identificaron a nivel de especie mediante PCR y secuenciación nucleotídica del gen de la calmodulina (Samson et al., 2015). Se analizó el perfil de susceptibilidad a los antifúngicos clínicos mediante la determinación de la concentración inhibitoria mínima (CIM) con el método de la micro dilución en caldo, de acuerdo al documento M38-A2 del CLSI.A aquellos aislamientos con valores de CIMs superiores a los valores de corte epidemiológicos, se les estudió la presencia de mutaciones en los genes cyp51A, cyp51B y cyp51C. Para ello, amplificaciones por PCR de dichos genes utilizando cebadores específicos (Paul et al., 2015), fueron secuenciados bidireccionalmente con ABI BigDye Terminator v.3.1 (Macrogen Inc.). Las secuencias obtenidas fueron alineadas con secuencias salvajes depositadas en el GenBank (NW0023477238, NW002477243, NW002477249) utilizando el algoritmo Muscle incluido en el programa Unipro UGENE v34.0.Todos los aislamientos fueron identificaron como A. flavus sensu stricto. De ellos, el 33,3% mostró valores de CIMs elevados a por lo menos un antifúngico triazólico. Uno de los aislamientos, mostró valores de CIMs altos para itraconazol (2 µg/ml), cuatro para voriconazol (4 µg/ml) y uno, para ambos antifúngicos (>8 µg/ml en ambos casos). Se observaron mutaciones puntuales en el CYP51Cde todos los aislamientos non-wild-type. Sin embargo, algunas de estas mutaciones fueron también encontradas en las cepas wild-type; lo cual está en relación con la naturaleza polimórfica de este gen (Paul et al., 2015). Los genes cyp51A y cyp51B no mostraron mutaciones asociadas a resistencia, aunque se observó presencia de codones de iniciación alternativos (no AUG) en algunas secuencias del CYP51A. La síntesis proteica generalmente comienza en un codón de inicio definido por un AUG y su secuencia circundante preferida; conocida en Eucariotas como secuencia de Kozak. La importancia cuantitativa de este contexto en los diferentes genes CYP51 no ha sido estudiada. Sin embargo, se ha visto en otras especies que la utilización de codones de inicio no AUG con contexto Kozak alternativo es utilizado con fines de lograr más de una localización intracelular, o como un mecanismo adicional de regulación de la traducción ante el estrés (Kearse y Wilusz, 2017). Este último mecanismo podría dar a las células el potencial de provocar respuestas rápidas y reversibles a cambios ambientales repentinos y situaciones de estrés (por ejemplo, en este caso, exposición a fungicidas triazólicos). Este control de la traducción juega un papel clave en la determinación de la abundancia de proteínas y la composición del proteoma y, probablemente, lograría regular la expresión de proteínas en un ambiente adverso. Por lo cual, se podría inferir que la síntesis de CYP51 en A. flavus podría variar entre los diferentes genes (CYP51A, B y C) a consecuencia del estrés ambiental causado por exposición a fungicidas usados en prácticas agrícolas. Es importante destacar que también podrían actuar otros mecanismos asociados a la resistencia a los antifúngicos como, por ejemplo, la sobreexpresión de los transportadores de eflujo (Price et al., 2015). Más estudios son necesarios para poder demostrar las implicancias del uso de codones no AUG en CYP51A y la secuencia Kozak circundante.Como conclusión se documenta por primera vez la presencia de aislamientos de A. flavus provenientes de semillas de garbanzo y soja, resistentes a azoles de uso clínico, y se detecta la iniciación de la traducción mediante el uso de codones no AUG y variabilidad de las secuencias Kozak en los genes cyp51 para la síntesis de CYP51A.