Utilización de la tinción de células tánicas en hoja para la diferenciación entre Lotus tenuis y Lotus corniculatus.

ESCARAY FJ, M ROSATO, FL PIECKENSTAIN, JA ROSELLÓ, P CARRASCO, OA RUIZ

Chascomús, Argentina

Taller; IV Taller interdisciplinario de Lotus: aspectos genéticos, moleculares y ecofisiológicos de Lotus spp y sus simbiontes; 2008

El género Lotus abarca casi 200 especies de distribución mundial, gracias a su adaptabilidad a diversos ambientes. Muchas de ellas revisten importancia agronómica por su valor forrajero y su utilización en la recuperación de zonas marginales para la agricultura. Un ejemplo de ello es la utilización de L. tenuis en la Pampa Deprimida (Buenos Aires, Argentina) donde la mayor parte de los suelos presentan problemas de anegamiento, salinidad, alcalinidad y deficiencia de fósforo, lo que causa la ausencia de leguminosas nativas y limita la implantación de leguminosas tradicionales como alfalfa y trébol (Mazzanti et al., 1986; Maiola, 2003). L. tenuis ha logrado adaptarse, aumentando el valor forrajero de los pastizales naturales y mejorando las condiciones edáficas gracias a la fijación biológica de nitrógeno. Por otro lado, también se encuentra L. corniculatus, leguminosa forrajera de mejor calidad que L. tenuis, aunque de distribución limitada a zonas menos restrictivas. L. tenuis es una especie diploide morfológicamente similar a L. corniculatus, especie tetraploide. Dada su similitud morfológica, es usual que las semillas comerciales de L. tenuis se encuentren contaminadas con L. corniculatus, disminuyendo así el éxito de implantación en áreas marginales. Las técnicas de diferenciación de ambas especies en estado de semilla o plántula son importantes para evaluar el porcentaje de contaminación. Si bien se han desarrollado varias metodologías para tal fin (Kade et al., 1997; Giorgieli et al., 1998; Galussi et al., 2006; Celotto y Sanso, 2007), las mismas requieren de laboratorios sofisticados, técnicos especializados y son relativamente caras. Li et al. (1996) reportaron variaciones en el patrón de distribución de células tánicas de 22 especies de leguminosas, incluyendo unas pocas accesiones de L. tenuis y L. corniculatus. El objetivo del siguiente trabajo es evaluar si el patrón de distribución de las células tánicas puede ser utilizado en la diferenciación inequívoca de estas dos especies, para lo cual se utilizaron doce poblaciones de L. tenuis (5 comerciales, 4 del Banco de Germoplasma de la Estación Experimental Agropecuaria Pergamino, 2 autotetraploides y una población nativa del Delta del Ebro, España). Además se utilizaron cuatro poblaciones comerciales de L. corniculatus y una población nativa de la Albufera de Valencia (España). Las semillas fueron escarificadas con ácido sulfúrico y sembradas en placas conteniendo agar:agua 0,8%, posteriormente trasplantadas en macetas con turba y cuando presentaron dos hojas verdaderas se retiró el folíolo central de la segunda hoja y los ápices de las raíces. Los individuos se mantuvieron vivos para la identificación morfológica. Los ápices de raíces fueron tratados con 8-hidroxiquinolina y fijados en etanol/acético (3:1). El material fijado fue tratado con celulasa (2%) y pectinasa (0,5%), hidrolizado en ácido clorhídrico 1N por 10 min a 60°C, los cromosomas fueron teñidos con hematoxicilina propiónica, y posteriormente observados bajo microscopio para determinar el número cromosómico. Las hojas fueron decoloradas y teñidas según el Li et al. (1996), al igual que la cuantificación del contenido de TC solubles e insolubles en hojas de 4 individuos de cada población elegidos al azar. La mayoría de los individuos de las poblaciones de L. tenuis fueron diploides (2n = 12), las accesiones Esmeralda y Larrañaga presentaron contaminaciones con tetraploides (2n = 24), mientras que las poblaciones autotetraploides fueron en su totalidad 2n = 24. Los individuos de las poblaciones de L. corniculatus resultaron tetraploides en su totalidad, excepto los de la población encontrada en la Albufera de Valencia, los cuales resultaron ser diploides. Las hojas teñidas se pudieron diferenciar en dos grupos, de acuerdo a la presencia o ausencia de células tánicas en el mesófilo. En este sentido, todos los individuos de las poblaciones de L. tenuis (salvo las contaminaciones encontradas en Esmeralda y Larrañaga) no presentaron células tánicas distribuidas en el mesófilo, mientras que dicha característica anatómica se encontró presente en todos los individuos de las poblaciones de L. corniculatus. El contenido promedio de TC solubles, insolubles y totales en hojas las poblaciones de L. tenuis fue de 0,047 ± 0,038; 0,490 ± 0,223 y 0,537 ± 0,243 mg EC/g MS respectivamente. No se encontraron diferencias significativas en el contenido de TC entre las diferentes poblaciones de L. tenuis estudiadas, mientras que el promedio para las poblaciones de L. corniculatus fue de 4,102 ± 2,116; 6,028 ± 2,874 y 10,131 ± 4,584 mg EC/g MS para los TC solubles, insolubles y totales, respectivamente. Las poblaciones Albufera de Valencia y San Gabriel fueron las que presentaron los niveles más elevados de TC en hoja. La técnica de diferenciación cariológica de estas dos especies de Lotus es la más utilizada en Argentina, sin embargo puede presentar fallos debido a la presencia de L. tenuis tetraploides y L. corniculatus diploides y a la vez es una técnica poco práctica para ser utilizada rutinariamente. Por lo tanto, la metodología de tinción de células tánicas en las primeras hojas resulta una alternativa confiable para diferenciar a las dos especies, además de ser una técnica simple y económica que posibilita su utilización rutinaria.