Fotomarcación de proteínas con una sonda mínima (diazirina) acoplada a la detección por espectrometría de masa

MUNDO, MARIANA R; GÓMEZ, GABRIELA E; DELFINO, JOSÉ M

La Plata, Buenos Aires

Congreso; XXXVII Congreso de la Sociedad Argentina de Biofísica (SAB); 2008

SAB

Diazirina (DZN) es un gas a temperatura ambiente, de tamaño y forma similar al agua. Debido a sus características geométricas la distribución general de DZN en relación con las proteínas será en principio, similar a la del solvente acuoso. Por irradiación UV, DZN genera metilén carbeno, que reacciona instantánea e inespecíficamente con su celda molecular inmediata, insertándose aún en uniones C-H. Así, el fenómeno de marcación de la cadena polipeptídica (metilación) será inespecífico y dependerá primariamente de su grado de exposición al solvente. Diazirina tritiada (3H-DZN) ha sido utilizada en nuestro laboratorio en el estudio de la estructura y plegamiento de proteínas solubles (1, 2) y en la identificación de superficies de interacción entre proteínas (3), obteniéndose, por primera vez, una medida experimental del área superficial accesible al solvente (ASA) en biomoléculas. 3H-DZN permitió la cuantificación precisa del nivel de marcación aún en niveles de modificación muy pequeños. Una alternativa analítica, es la detección por espectrometría de masa (ESI-MS) de los productos M+n*14 originados por la metilación de la cadena polipeptídica. La resolución de los espectros de masa obtenidos permitió estimar el grado de marcación promedio de la cadena polipeptídica (GMP), cuya magnitud es función lineal de la oferta de reactivo. Normalizada la oferta de DZN, este parámetro demostró ser sensible al estado conformacional de diferentes proteínas globulares, resultado esperable dado el aumento de ASA asociado al desplegamiento de la cadena polipeptídica. La evaluación de GMP en la transición nativo-desnaturalizado de a-lactalbúmina fue consistente con medidas derivadas de técnicas espectroscópicas clásicas (dicroísmo circular y fluorescencia intrínseca). Actualmente, nuestro interés se ha focalizado en lograr la marcación de péptidos, lo que posibilitará la identificación y análisis más detallado de la zona de la proteína marcada. Elegimos como modelo al complejo de alta afinidad formado entre calmodulina y melitina purificadas a partir de seso bovino y veneno de abeja, respectivamente. La fotomarcación de proteínas y péptidos con DZN constituye una nueva aplicación de ESI-MS al análisis conformacional de proteínas y al mapeo de interfases entre dominios proteicos involucrados en la formación de complejos.