Diseño y evaluación de un protocolo de extracción múltiple de restos vegetales, polen, silicofitolitos, ADN, parásitos e isótopos estables de heces de Lama guanicoe

NADIA VELÁZQUEZ ; ROMINA PETRIGH; LAURA BENVENUTO; ANA CECILIA MARTÍNEZ TOSTO; IVANA CAMIOLO; PATRICIA PALACIO; MARTÍN FUGASSA; LUCIANO VALENZUELA; LIDIA SUSANA BURRY

Córdoba

Congreso; XX Congreso Nacional de Arqueología Argentina; 2019

La coprología es la disciplina que estudia el contenido de los coprolitos (heces subfósiles y fósiles) (Reinhard y Bryant 1992, 2008). Esta disciplina permite realizar estudios de paleodieta, de rango de acción, de estacionalidad en el uso de cuevas y aleros, de enfermedades parasitarias, abordar aspectos culturales y complementar las reconstrucciones paleoambientales. La información que se obtiene de estos análisis es muy valiosa para comprender el comportamiento de los organismos en el pasado. La metodología utilizada habitualmente consiste en la división del coprolito en diferentes submuestras antes del procesamiento. Estas submuestras se destinan a los diferentes tipos de análisis (Wood et al. 2016). En general, la recuperación de restos incluidos en los coprolitos incluye los siguientes pasos (Bryant 1974): 1. descarte de la parte externa, para asegurar que los restos recuperados no sean producto de contaminación; 2. división de los coprolitos en submuestras para realizar los diferentes procesamientos de extracción de los restos; 3. defloculación de las submuestras para desagregar los restos de interés; 4. extracción de los microrrestos con sustancias químicas; 5. concentración para su observación bajo microscopio óptico. La ejecución de estos pasos, muchas veces, produce pérdida de material que genera una muestra escasa que no permite la cuantificación y el análisis de múltiples proxies. Por esta razón, propusimos diseñar y evaluar un procesamiento que permita la extracción conjunta de diversos restos optimizando el material disponible sin perder el nivel de resolución de análisis. La filtración es unatécnica sencilla que se utiliza para remover partículas orgánicas y minerales de gran tamaño durante la extracción polínica de sedimentos. Esta técnica es recomendable cuando se trabaja con volúmenes pequeños de muestra (Gray 1965). Cywnar et al. (1979) introdujeron la técnica de filtración fina para extraer polen de sedimentos minerales sin la utilización de sustancias químicas. Teniendo en cuenta la morfología y tamaño del polen (esférico o elíptico y de 10 a 100 μm, respectivamente) utilizaron distintas mallas plásticas con apertura de poro de 5, 7, 10 y 15 μm para llevar a cabo la filtración. A diferencia del procesamiento estándar, obtuvieron una concentración polínica mayor y una mejorcalidad de la observación microscópica, permitiendo reducir el tiempo de conteo al microscopio óptico. Aunque estos autores no probaron esta técnica en muestras de sedimentos orgánicos recomiendan su utilización.Por otra parte, uno de los problemas en el estudio de los coprolitos es el tamaño y morfología de la deposición, la cual varía según el origen zoológico. Cuando el tamaño de los coprolitos es grande, con un peso mayor a 1g, la división del material en diferentes submuestras, para el análisis de los distintos restos, es una alternativa (Bryant 1974). Sin embargo, cuando el tamaño de la muestra es menor, como sucede con las heces de Lama guanicoe (aproximadamente 0,3 g/feca) (Velázquez y Burry 2012), la división en submuestras puede presentar el inconveniente de obtener una baja concentración de los restos de interés (Reinhard y Bryant 1992). En nuestro equipo de investigación abordamos el análisis de coprolitos recolectados en sitios arqueológicos desde un enfoque interdisciplinario. En tal sentido, dada la experiencia de los distintos investigadores, nos interesa identificar y cuantificar polen, fragmentos vegetales, estadios parasitarios y silicofitolitos presentes en los coprolitos y además determinar su origen zoológico mediante el análisis de ADN antiguo (ADNa).Para llevar a cabo este análisis múltiple sobre heces de Lama guanicoe, se pretende optimizar un protocolo único de procesamiento para el estudio de los restos mencionados. En esta primera etapa, el objetivo es proponer un protocolo de procesamiento mecánico de extracción múltiple de restos de heces actuales de Lama guanicoe. Materiales y MétodosSe utilizaron heces procedentes de un bosteadero de Lama guanicoe. El muestreo fue realizado a principio del otoño en el área de la Cueva Milodón Norte 1, cuenca del lago Pueyrredón, provincia de Santa Cruz (47º00?S; 72º15?O).Se realizó el diseño del protocolo mecánico de acuerdo a las observaciones macroscópicas de las muestras y a las propiedades físico-químicas (tamaño, fragilidad, etc) de cada uno de los proxies. Además, se tuvo en cuenta que las soluciones utilizadas en el procesamiento no sean incompatibles entre los diferentes proxies. Para rehidratar las heces secas y deflocularlas, se colocaron en recipientes con fosfato trisódico acuoso 0.5% a 4°C durante 72 hs y se agitaron en vortex. Se adicionó una tableta de esporas de Lycopodium clavatum con una concentración de 12542 esporas/tableta, que se utilizó como marcador foráneo. La filtración se llevó a cabo con mallas plásticas de diámetro de poro de 250 y 10 μm, de acuerdo a los diferentes tamaños de los restos, concentrando los restos vegetales en la primera malla y separándolos de los silicofitolitos, polen y parásitos que quedaron la mayoría retenidos sobre la superficie de la malla de 10 μm. El material retenido en cada malla fue lavado con buffer fosfato salino (PBS) 1X que no interfiere en el análisis de ninguno de los proxies.Se examinó la presencia de ADN necesaria para determinar el origen zoológico de las heces realizando una extracción de ADN de la mitad separada y amplificación por PCR de un gen específico de camélidos.Se observaron los residuos obtenidos en la malla de 10 μm para evaluar la presencia de polen, silicofitolitos y restos parasitarios al microscopio óptico con aumentos de 400 y 1000X.Resultados y conclusionesEl protocolo preliminar aplicado para el análisis conjunto de los diferentes restos consistió en:1- registro del peso de las heces en balanza de alta precisión, medición del diámetro y longitud bajolupa binocular y caracterización organoléptica,2- separación del córtex (aproximadamente 1 mm) (SE: submuestra externa) con bisturí,3- división de la parte interna (SI: submuestra interna) en dos secciones, una para la determinacióndel origen zoológico por ADN, y otra para el análisis de restos vegetales, polen, silicofitolitos y restosparasitarios,4- registro del peso de las dos secciones de la SI,5- adición de una tableta de esporas de Lycopodium clavatum y rehidratación con fosfato trisódicoacuoso 0.5% a 4°C durante 72 hs,6- agitación con vortex,7- filtración a través de mallas plásticas de 250 y 10 μm de diámetro de poro,8- recuperación de los restos retenidos en la malla de 250 μm para el análisis de restos vegetales,silicofitolitos e isótopos de carbono y nitrógeno,9- recuperación de los restos retenidos en la malla de 10 μm por medio de lavados con PBS 1X, centrifugación a 1500 rpm por 5 min y división del precipitado obtenido en tres submuestras para el análisis de polen, silicofitolitos y restos parasitarios.Se realizó un análisis cualitativo de polen, silicofitolitos y parásitos. Los resultados preliminares muestran: a) restos vegetales retenidos en la malla de 250 μm, b) granos de polen de Poaceae, Asteraceae subfam. Asteroideae, Asteraceae subfam. Cichoroideae, Mulinum, Adesmia, Rumex, Podocarpus,Cerastium, Acaena, entre otros, retenidos sobre la malla de 10 μm, no se observaron granos de polen rotos o arrugados y se identificaron esporas de Lycopodium clavatum en buen estado, c) se registróuna larva de un nematode y no se observaron huevos u ooquistes parasitarios, d) los silicofitolitosobservados sobre la malla de 10 μm fueron encontrados en su mayoría articulados y sin rasgos de degradación. Los mismos corresponden principalmente al tejido epidérmico vegetal y tejido vascular.Morfologías tales como, rondels, trapeziformes y elongados fueron asociadas a la familia Poaceae subfam. Pooideae; y tabulares polilobados y poliédricos a dicotiledóneas, f) el análisis de ADN resultó positivo para camélidos para un rango de peso seco de 100 a 50 mg. Se comparará este protocolo con el método estándar de recuperación de los diferentes proxies y se evaluará el porcentaje de pérdida de los diferentes restos en las mallas. Se continuará con el análisis de un mayor número de réplicas para evaluar este protocolo mecánico entérminos de degradación, recuperación de los distintos proxies (polen, restos vegetales, silicofitolitos y restos parasitarios) y de la calidad de las observaciones microscópicas.La optimización de este protocolo es necesaria para obtener información importante que será utilizada como referencia para interpretar los resultados del análisis de coprolitos.