Análisis de la variabilidad genética del Antígeno B de Echinococcus granulosus

KAMENETZKY L.

Misiones, Argentina

Workshop; Workshop para la evaluación de proyectos binacionales del Centro Argentino-Brasileño de Biotecnología (CABBIO); 2003

Centro Argentino-Brasileño de Biotecnología (CABBIO)

Se ha estudiado la variabilidad genética del AgB en las cepas de Echinococcus granulosus encontradas en Argentina y Brasil. Se analizaron ADNs genómicos de quistes hidatídicos de dichas cepas. Se amplificó el gen AgB/2 mediante PCR, y se clonaron los productos obtenidos. Se analizaron mediante SSCP, 50 clones de cada cepa observándose un gran número de patrones para cada una de ellas. Los insertos que mostraron patrones diferentes fueron secuenciados. Se observó una gran diversidad entre las secuencias de una misma cepa, la que resultó aún mayor cuando se compararon secuencias de AgB/2 correspondientes a  distintas cepas. La mayor variabilidad se encontró en el intrón y en el segundo exón. El primer exón, que corresponde a la secuencia señal mostró menor variabilidad. Análisis filogenéticos mostraron que la mayoría de las secuencias de la cepa G1 se agrupan con las de G2, mientras que las de G5 y G6 lo hicieron con las correspondientes a G7, en concordancia con las agrupaciones obtenidas al analizar secuencias mitocondriales o nucleares de E. granulosus. El análisis de expresión mediante RT-PCR, clonado, SSCP, y secuenciación para las cepas G1 y G7, mostró que solamente 2 de las variantes genómicas son transcriptas. Las variantes expresadas en cada cepa tienen una identidad aminoacídica de 77, 17  %. Esta diversidad podría tener consecuencias en la modulación de la respuesta inmune del hospedador y en el diagnóstico de la hidatidosis. Se realizaron ensayos de expresión en E. coli de las variantes encontradas en cada cepa. Hasta el momento se ha logrado la expresión de la proteína recombinante del AgB2 de cepa G1. La proteína correspondiente a la cepa G7 resultó tóxica para la bacteria. En este momento se están realizando ensayos para expresar esta proteína en periplasma bacteriano y así evitar el efecto tóxico. Además se diseñaron primers para expresar estas proteínas en forma de pequeños péptidos para estudiar las zonas antigénicas. Esta nueva variante expresada podría ser evaluada en ensayos de ELISA con el propósito de mejorar el diagnóstico de la hidatidosis y hacerlo abarcativo para todas las cepas del parásito. También se ha comenzado el análisis de la variabilidad antigénica del AgB/1 en las cepas G5, G6 y G7 con la misma metodología. Hasta el momento se han detectado 6 variantes genómicas en la cepa G7 algunas de ellas difieren en tamaño, y todas difieren de las varianes de AgB/1 que han sido descriptas en cepa oveja  por nuestra contraparte brasileña. En la cepa G6, se detectaron 4 variantes genómicas, 2 idénticas a cepa G7 y  2 nuevas variantes. En la cepa G5, es el único caso en el que se obtuvieron dos bandas de amplificación que han sido clonadas por separado y analizadas por SSCP. Se está realizando la secuenciación de los clones que presentaron distintos patrones de SSCP. Con los datos obtenidos se ha determinado el número de variantes aminoacídicas y se han calculado las diversidades nucleotídicas, dentro y entre cepas, para ambos antígenos. Estos resultados indican que el AgB/1 presenta una variabilidad comparable a la del AgB/2.