Marcadores moleculares para el estudio de cepas de Echinococcus granulosus

KAMENETZKY L.

Esperanza Santa Fe

Jornada; Jornadas Nacionales de Hidatidosis; 2003

Asociación Internacional de Hidatidología

Para caracterizar las diferentes variantes de este parásito se han utilizado criterios morfológicos, metabólicos, de desarrollo, de proteínas, enzimáticos y de ADN (Eckert & Thomspon, 1997). Las técnicas moleculares al permitir la caracterización directa del genoma del parásito tienen la ventaja de que no se confunden con variabilidad inducida por el hospedador, el ambiente o la asociada al estadío del parásito. Además son independientes de modificaciones post-traduccionales. Los estudios que se realizaron sobre las variantes genéticas de E. granulosus involucran tanto ADN mitocondrial  como nuclear (Bowles & McManus, 1993a). El ADN mitocondrial tiene una tasa de evolución relativamente rápida y es útil para la determinación de poblaciones cercanas. También por ser haploide y no recombinar simplifica el análisis (Thanh et al., 2000). Los genes nucleares ribosomales tienen diferentes regiones que evolucionan a distintas velocidades y son utilizadas para estudio de heterogenicidad genética en varios niveles taxonómicos (Bowles & McManus, 1993a).Dos genes mitocondriales son particularmente útiles para identificar las variantes de E. granulosus, el gen de la subunidad 1 de la enzima citocromo c oxidasa (CO1) y el gen de la NADH dehidrogenasa 1 (ND1). Mediante la secuenciación de dichos genes se encontraron 10 genotipos distintos. De las diversas técnicas disponibles en biología molecular aquellas que involucran PCR son especialmente útiles en estudios de variantes de E. granulosus debido a que la disponibilidad de ADN por aislamiento, es decir, por quiste o adulto individual es baja y la técnica de PCR tiene alta sensibilidad. Asimismo la secuenciación de los productos obtenidos por PCR permite determinar variaciones a nivel nucleotídico que pueden ser fácilmente comparadas en diferentes laboratorios gracias a la información provista por los bancos de datos en Internet. Otra forma de determinar las variantes de E. granulosus es realizando PCR sobre el espaciador transcripto interno (ITS1) del ADN ribosomal y analizando el polimorfismo de longitud de los fragmentos de restricción (RFLP) que  se generan al digerir el ITS1 con diversas enzimas (Bowles & Mcmanus, 1993c). Esta técnica permite distinguir entre los genotipos G1 y G2 por un lado y G6 y G7 por otro, pero tiene el inconveniente de que no permite distinguir G1 de G2, ni G6 de G7. El polimorfismo de amplificación al azar de ADN mediante PCR (RAPD-PCR) también se utilizó para determinar variantes (Siles-Lucas et al., 1994), si bien es una técnica sencilla tiene el inconveniente de ser poco reproducible y en general necesita de otra técnica que la confirme (Eckert & Thompson, 1997). El análisis de conformación de fragmentos simple cadena (SSCP) de diferentes zonas del genoma también es útil para definir variantes de E. granulosus. Esta técnica permite detectar mutaciones puntuales debido a que la movilidad de los fragmentos simple cadena en geles no desnaturalizantes depende de la estructura primaria del fragmento en estudio. La probabilidad de detectar una mutación puntual es de 89-99% para fragmentos de 100-450 pb. Cuanto mayor es el tamaño del fragmento menor es la sensibilidad de la técnica (Lessa & Applebaum, 1993). El método de SSCP es particularmente útil cuando se quiere estudiar un gran número de muestras ya que permite analizar varios aislamientos a la vez sin necesidad de secuenciar. Las diferentes cepas de E. granulosus pueden determinarse aplicando la técnica de SSCP a genes mitocondriales (Zhang et al., 1999). Utilizando esta técnica sobre diferentes partes del genoma de E. granulosus, por ejemplo, la región regulatoria de la enzima malato dehidrogenasa citosólica (MDH),  pudo analizarse la variabilidad entre y dentro de las cepas. La técnica de Southern blot también es utilizada para estudios del genoma de E. granulosus (Siles-Lucas et al., 1994; Rosenzvit et al., 1997). Es útil debido a que pueden analizarse sobre las mismas muestras varios sitios del genoma simplemente cambiando la sonda con la que se realizan los estudios. El inconveniente de esta técnica es que se necesita mucha cantidad de ADN de cada aislamiento. Este inconveniente puede superarse si se utilizan como sondas fragmentos que se encuentren muy representados en el genoma del parásito. Un fragmento particularmente útil es el repetido no transcripto (TREG) que está presente en el genoma de E. granulosus en alto número de copias (Rosenzvit et al., 1997). Otro tipo de elementos repetidos son los microsatelites, repeticiones de pocas pares de bases que son particularmente útiles en estudios poblacionales. La identificación y caracterización del microsatélite U1 snRNA de E. multilocularis ha permitido contar con un marcador hipervariable que es útil para discriminar parásitos de diferentes localidades (Bretagne et al., 1996). Hasta el momento, sólo un microsatélite se ha sido descripto para E. granulosus (Bartholomei-Santos et al., 2003). Su capacidad de discriminar los diferente genotipos presentes en la Argentina será evaluada en este trabajo.  En nuestro laboratorio se utilizaron conjuntamente las técnicas de PCR-RFLP sobre el fragmento ITS1 y la secuenciación de los genes mitocondriales CO1 y ND1 para la determinación de cepas del parásito (Rosenzvit et al., 1999). Estos tres marcadores moleculares mostraron ser coincidentes en la clasificación de las muestras analizadas, por lo tanto en este trabajo se continuó determinando la cepa solamente con la técnica de secuenciación de CO1 y se realizaron otros análisis sobre regiones independientes del genoma para poder determinar la variabilidad dentro y entre cepas.