CARACTERIZACIÓN DEL PROMOTOR DEL GEN HAHB-4 DE GIRASOL

PABLO MANAVELLA; CARLOS DEZAR; RAQUEL CHAN

Buenos Aires

Congreso; II Congreso Argentino de Girasol; 2005

Asociaci¨®n Argentina de Girasol

   Las plantas están sometidas continuamente a cambios desfavorables en las condiciones del medio ambiente. Uno de estos cambios con efectos nocivos es la sequía que genera estrés hídrico. Las semillas suelen tolerar bien el estrés hídrico pero, la tolerancia es rara en las plantas desarrolladas. Sin embargo, existe un cierto grado de capacidad de adaptación generado por la expresión de conjuntos de genes específicos Los productos de estos genes, cumpliendo funciones diversas, son los que permiten a las plantas adaptarse a las alteraciones en las condiciones ambientales.  En trabajos previos hemos descripto el aislamiento, caracterización molecular y funcional de un gen de girasol perteneciente a la familia HD-Zip, Hahb-4. Estos estudios indicaron que la expresión de este gen aumenta en condiciones de déficit hídrico o en presencia de la hormona de ácido abscísico (ABA). En conjunto con los resultados obtenidos en ensayos de sobreexpresión en plantas transgénicas de Arabidopsis thaliana las observaciones realizadas nos permitieron proponer que Hahb-4 es un factor de trascripción involucrado en la respuesta a estrés hídrico mediada por ABA en girasol y que su función es proteger a la planta del estrés hídrico activando o reprimiendo distintos genes blanco. Generar plantas transgénicas es una de las estrategias posibles para el mejoramiento de especies vegetales. Para cumplir con este fin, es necesario contar con un gen que haya demostrado poder conferirle a la planta una característica ventajosa comparada con su par sin transformar. Por otro lado es necesario contar con una región promotora capaz de dirigir la expresión del gen elegido en los órganos donde éste sea necesario y/o en los momentos en los que la planta lo necesite. La expresión constitutiva lograda con promotores muy fuertes como el 35S del CaMV, suele generar a las plantas gastos metabólicos innecesarios que generalmente se traducen en cambios fenotípicos no deseados. De ahí, la necesidad de aislar y caracterizar promotores que puedan convertirse en herramientas biotecnológicas. El objetivo principal de este trabajo fue el de caracterizar la región promotora del gen Hahb-4 con el fin de determinar qué secuencias son las responsables de la expresión específica de órgano y de la inducción por estrés hídrico, salino o ABA. Con este objetivo hemos obtenido plantas transformadas en forma estable con diferentes fragmentos del promotor de Hahb-4 fusionados con la región codificante del gen de la β-glucuronidasa (gus), el cual funciona como gen reportero. Con estas plantas se realizaron ensayos histoquímicos con el fin de determinar la expresión del gen reportero en diferentes tejidos  y estados de desarrollo, así como también ensayos de tipo northern blot para poder observar la respuesta de cada una de estas construcciones en distintas condiciones. De estos estudios se pudo determinar que los dos alelos del promotor son capaces de dirigir la expresión del gen gus en raíces, cotiledones y hojas durante todo el ciclo vital, no detectándose expresión en los tejidos reproductivos. El análisis de las deleciones seriadas del promotor sugirió que es necesario un fragmento mínimo de 417/421 pb para observar expresión basal del promotor. Las construcciones seriadas desde 400 pb hasta 800/1000 pb muestran el mismo patrón de expresión en órganos. En las construcciones de mayor tamaño aparece una nueva señal en el cilindro central de raíz. Posteriormente, se construyeron quimeras con distintos segmentos. Una construcción con las 100 pb adyacentes al sitio de inicio de la transcripción y las últimas 200 pb en el extremo 5´ de este promotor permitió localizar la región responsable de la expresión en el cilindro central de la raíz en las 200 pb del extremo 5´. Una construcción que excluye la región entre -100 y -600 pb permitió localizar el sitio de expresión en parénquima y nacimiento de raíces laterales entre los nucleótidos -300 y -400. La expresión del gen gus dirigida por el promotor de Hahb-4 e inducida por estrés hídrico, ABA o NaCl fue observada sólo en las construcciones mayores a 600 pb y se intensificó notoriamente cuando se incluyeron 1000pb. Esto nos permite ubicar los sitios de respuesta a estrés en regiones corriente arriba de -600 y -800 pb. El conjunto de resultados nos permitió identificar dentro del promotor de Hahb-4 las distintas regiones responsables de la expresión del gen y de su respuesta al estrés ambiental y visualizar su posible utilidad como herramienta biotecnológica.