DETERMINACIÓN POR MICROSCOPÍA RAMAN DE LAS MODIFICACIONES BIOQUÍMICAS Y ESTRUCTURALES EN EL CITOPLASMA DE OVOCITOS BOVINOS DURANTE LA MADURACIÓN IN VITRO

JIMENEZ, LUIS EMANUEL; MARIELA ROLDÁN OLARTE; ALVAREZ, RMS

San Miguel de Tucumán

Congreso; Reunión Conjunta de Sociedades de Biología; 2020

Sociedades de Biología

En los últimos años, las técnicas aplicadas en la producción in vitro de embriones bovinos han cobrado gran importancia, no obstante, el desarrollo de embriones hasta el estadio de blastocisto mediante esta metodología es limitado. Se demostró que la calidad de los ovocitos es un factor determinante en la eficiencia de este proceso, por lo tanto, la capacidad para identificar ovocitos competentes para la fecundación luego de ser madurados in vitro podría contribuir a un aumento en las tasas de producción de embriones. Durante la maduración, el ovocito sufre cambios bioquímicos y morfológicos a nivel nuclear y citoplasmático, separados pero sincronizados entre sí. El objetivo de este trabajo fue estudiar, mediante microscopía Raman, las modificaciones bioquímicas del citoplasma en los ovocitos bovinos a lo largo del proceso de maduración in vitro. Se estudiaron los ovocitos inmaduros (INM) y otros que permanecieron en las condiciones de maduración in vitro durante 6, 18 y 22 horas (MIV-6H, MIV-18H y MIV-22H). Para un análisis más preciso de los cambios en el citoplasma a lo largo de este proceso, se eliminó la zona pelúcida (ZP) de todos los ovocitos mediante tratamiento enzimático. Posteriormente los ovocitos sin ZP fueron fijados, lavados y conservados en PBS/ BSA a 4°C. Los espectros Raman se adquirieron utilizando un microscopio confocal acoplado a un espectrómetro Raman equipado con un láser de 780 nm; se irradiaron 5 diferentes puntos del citoplasma de cada ovocito, seleccionados mediante un objetivo de 20X, que luego se promediaron para dar un espectro representativo de cada ovocito. Con el fin de poder realizar la comparación espectral entre los distintos estados de maduración, se obtuvo un espectro promedio representativo de cada grupo, mediante la suma de los espectros de cada ovocito. El espectro del grupo MIV-6H mostró que las intensidades de las bandas de azúcar disminuyeron, mientras que las bandas de los lípidos se intensificaron considerablemente, con respecto al espectro de ovocitos INM. Ello se debería a la utilización de glúcidos como fuente de energía al inicio de la maduración y a un aumento de la cantidad de gotitas lipídicas, cuyo componente principal son los triglicéridos. El espectro MIV-18H no mostró diferencias espectrales significativas con respecto al contenido de lípidos y proteínas en comparación con el grupo MIV-6H. Sin embargo, las bandas características de proteínas se manifestaron notablemente intensificadas en el espectro MIV-22H con respecto a los otros tres grupos. Además, la señal que corresponde a los triglicéridos (1732 cm-1) se observó más débil que en los espectros del grupo MIV-18H, lo que indica que los triglicéridos fueron utilizados como fuente de energía durante las últimas horas de la maduración. Estos resultados muestran que la espectroscopía Raman puede ser utilizada como una poderosa herramienta analítica para determinar la calidad de los ovocitos bovinos madurados in vitro y su competencia para la fecundación.