INVESTIGADORES
ROLDAN OLARTE Eugenia Mariela
congresos y reuniones científicas
Título:
Aislamiento y Purificación de membrana plasmática de células oviducales
Autor/es:
ROLDÁN OLARTE, E. M., MICELI, D. C.
Lugar:
San Miguel de Tucuman, Tucuman, Argentina
Reunión:
Jornada; Jornadas de Divulgación de Trabajos de Pasantías; 1997
Institución organizadora:
CIUNT (Consejo de Investigaciones de la UNT)
Resumen:
AISLAMIENTO Y PURIFICACIÓN DE MEMBRANA PLASMÁTICA DE CÉLULAS OVIDUCALES   Autor: Eugenia Mariela Roldán Olarte Director: Dora Cristina Miceli  Lugar de trabajo: Instituto de Biología - INSIBIO -               Recientemente se encontraron evidencias de que las hormonas esteroideas pueden ejercer su acción a través de un mecanismo no clásico según el cual se unen a receptores ubicados en la membrana plasmática y mediante la acción de segundos mensajeros manifiestan su efecto biológico. Con el objeto de estudiar si la fracción subcelular enriquecida en membrana plasmática fue obtenida con el propósito de estudiar si existen sitios de unión o receptores para progesterona en la membrana plasmática de células oviducales se desarrollaron técnicas para la obtención de una fracción subcelular rica en membrana plasmática.             Las muestras biológicas utilizadas fueron oviductos de cerdo. Éstos se clasificaron en dos lotes, luteales y estrogénicos, basándose en las características morfológicas de los folículos ováricos, los cuales varían notoriamente de acuerdo a su estado funcional durante todo el ciclo estral.              Para la obtención de membrana plasmática se trabajó con células del epitelio secretor, obtenidas por raspado de la cara interna del oviducto y también directamente con todo el tejido oviductal. En ambos casos se homogeneizó el tejido, resuspendido en buffer, en Ultraturrax T25 a 9500 rpm durante 10 seg. de 5 a 6 veces en baño de hielo.              Se probaron distintos métodos: 1)     Se centrifugó el homogenado a 1000g. 10 min. y el sobrenadante se recentrifugó a 40.000 g 45 min. El pellet se resuspendió en buffer, se sonicó en frío 15 min. y se lavó dos veces. El pellet final se resuspendió en pequeño volumen de buffer. 2)     El homogenado se colocó sobre solución de sacarosa al 41% y se centrifugó en rotor basculante a 95.000 g. 1h. Se separó la interfase la cual se presenta como un anillo blanquecino y se resuspendió en buffer. Se lavó dos veces, centrifugando a 95.000 g, 25 min. en rotor de ángulo fijo. El pellet final fue resuspendido en el mismo buffer y almacenado a -20º o -70ºC, hasta su utilización.  De los métodos anteriormente citados, el óptimo para el tejido oviductal fue el que requiere la ultracentrifugación de equilibrio en gradiente de sacarosa al 41%. En las fracciones obtenidas se ensayó la actividad de la enzima 5´nucleotidasa como marcadora de membrana plasmática y se realizaron controles al microscopio electrónico de transmisión. La fracción celular enriquecida en membrana plasmática se usó para determinar la presencia de receptores de progesterona. Se usó el método de unión de progesterona tritiada y desplazamiento con progesterona fría para determinar la capacidad y afinidad de las uniones específicas. Se determinó la presencia de sitios de unión con una capacidad de 6.581 fmol/mg y una constante de disociación de Kd: 9,76nM