Regulación transcripcional del gen rcsB de Salmonella enterica serovar Typhimurium por el factor de virulencia SlyA

MOHAMED, MF; FABIAN E. LOPEZ; MÓNICA A. DELGADO; MARÍA DE LAS MERCEDES PESCARETTI

San Miguel de Tucumán

Congreso; IX Congreso Nacional de Estudiantes de Bioquímica y Biotecnología. XVI Jornadas Científicas y Encuentro de Jóvenes Investigadores ?Augusto E. Palavecino?; 2015

El sistema RcsCDB de Salmonella enterica serovar Typhimurium (S. Typhimurium) regula la síntesis de ácido colánico y flagelo, expresión de genes de virulencia, entre otros. Este sistema es inusual ya que está compuesto por el sensor RcsC, el regulador RcsB y RcsD. Resultados de nuestro laboratorio demostraron que la activación constitutiva del gen del sensor RcsC atenúa la virulencia de Salmonella en modelo animal. Por otro lado, se ha reportado que mutantes en el gen slyA, al igual que rcsC11, atenúan la virulencia en ensayos de infección con ratones. Objetivos: El objetivo de este trabajo fue determinar si el factor de virulencia SlyA era capaz de regular la expresión de rcsB, teniendo en cuenta que dicho regulador es expresado por actividad de dos promotores, uno activo en fase exponencial y otro en fase estacionaria del crecimiento. Materiales y Métodos: Se realizó un estudio bioinformático de ambas regiones promotoras del gen rcsB, PrcsDB y PrcsB, Para comprobar la funcionalidad del sitio de unión encontrado para SlyA sobre PrcsB, se determinó el efecto de dicho regulador sobre la trascripción de rcsB mediante determinación de actividad B-galactosidasa. Para analizar la capacidad de unión del regulador SlyA a la región promotora de rcsB se realizaron ensayos de retardo en gel. Luego, se clonó el gen slyA en el vector de expresión pT7.7 donde se agregó además una etiqueta de 6 histidinas para facilitar su purificación. Luego de sobreproducir la proteína SlyA se purificó siguiendo el protocolo puesto a punto en nuestro laboratorio. Finalmente, se realizó el ensayo de retardo en gel empleando un producto de PCR obtenido de la amplificación de región promotora de PrcsB y su hibridación con la proteína SlyA.Resultados: El estudio bioinformático reveló la presencia de un posible sitio de unión del regulador SlyA en la región promotora de PrcsB.Los resultados de actividad B-galactosidasa determinaron que SlyA es capaz de regular de manera negativa la transcripción de rcsB. Se logró el clonado del gen slyA en el vector de expresión pT7.7 y la sobreexpresión de dicho gen. Luego se obtuvo la proteína pura para los ensayos de retardo en gel. Los resultados obtenidos de este ensayo demuestran que SlyA se une directamente al promotor de fase estacionaria PrcsB regulando negativamente la expresión de rcsB. Conclusiones: Nuestros datos demuestran que SlyA regula negativamente y en forma directa la expresión de rcsB, por unión al promotor de fase estacionaria PrcsB.