CONTRATADOS
GIULIETTI Ana Maria
congresos y reuniones científicas
Título:
Estrategias para producción de antraquinonas cultivos in vitro de Rubia tinctorum
Autor/es:
PERASSOLO M; GIULIETTI A M; RODRIGUEZ TALOU, J
Lugar:
Buenos aires
Reunión:
Jornada; XII Jornadas de Farmacia y Bioquímica Industrial - JorFyBI 2015; 2015
Institución organizadora:
Asociación argentina de Farmacia y Bioquímica Industrial
Resumen:
IntroducciónLas antraquinonas (AQs) son metabolitos secundarios que han sido utilizados tradicionalmente como colorantes en la industria, pero que además presentan numerosas aplicaciones terapéuticas, tales como actividad antitumoral y para el tratamiento de la Hepatitis C. Si bien son producidas principalmente por síntesis química, hay una tendencia hacia procesos sustentables que minimicen el uso y generación de sustancias peligrosas, disminuyendo así los efectos adversos sobre el medio ambiente. Por este motivo, una alternativa para su obtención es el cultivo in vitro de especies vegetales productoras. Este tipo de cultivos representa alternativa promisoria para la producción de metabolitos secundarios con aplicación farmacéutica, debido a que posibilitan la implementación de normas GMP, evitan la explotación de la fuente natural y operan en condiciones suaves de temperatura y pH. La principal limitación de esta plataforma suele ser los bajos niveles de metabolitos acumulados, lo que puede solucionarse mediante la aplicación de estrategias tales como la elicitación. Esta consiste en enfrentar a los cultivos vegetales con compuestos que desencadenen una respuesta de defensa que generalmente involucra la acumulación de metabolitos secundarios. El metiljasmonato (MeJ) es uno de los elicitores más ampliamente utilizados, y ha sido empleado con éxito para favorecer la acumulación de numerosos metabolitos secundarios, recientemente, se ha descripto su uso en combinación con ciclodextrinas (CDs), para favorecer la producción y liberación de metabolitos secundarios en varias especies. El objetivo de este trabajo fue estudiar el efecto de la adición combinada de 2-hidroxipropil-b-ciclodextrina (HPCD) y MeJ sobre la producción de AQs en cultivos de suspensiones celulares y de raíces transformadas de Rubia tinctorum. Materiales y métodos. Obtención y mantenimiento de los cultivos: Las suspensiones se mantuvieron en medio Gamborg B5, adicionado con: sacarosa (20 g/l), ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2 mg/l), ácido indolacético (0,5 mg/l), ácido naftalenacético (0,5 mg/l) y kinetina (0,2 mg/l); pH final: 5,75-5,80. Las raíces fueron obtenidas por infección de explantos de R. tinctorum con Agrobacterium rhizogenes LBA 9402 y fueron cultivadas en medio Gamborg B5, con la mitad de la concentración salina y adicionado con sacarosa (20 g/l). En ambos casos, los cultivos se mantuvieron en condiciones controladas de temperatura (24±2°C), fotoperíodo (16/8) y agitación (100 rpm). Ensayos de elicitación combinada en suspensiones: los cultivos fueron iniciados con 2,5 g de biomasa (peso fresco, PF) en 25 ml de medio de cultivo, en erlenmeyers de 100 ml de capacidad. Se trabajó con dos lotes de medio de cultivo, uno con el agregado de HPCD 20 mM. Luego de 3 días de incubación, algunas de las suspensiones fueron tratadas con 0,1 mM de MeJ, de forma tal que el ensayo adquirió un diseño factorial de 2 variables (HPCD y MeJ) en 2 niveles (0 y 1 mM MeJ; 0 y 20 mM HPCD). La Tabla 1 muestra el diseño del ensayo. El análisis de la producción de AQs se realizó a los 3, 6 y 8 días de cultivo. Ensayos de elicitación combinada en raíces: En este caso se trabajó con 0,2 gPF de biomasa en 25 ml de medio de cultivo. Las raíces fueron cultivadas en el medio habitual, con y sin HPCD durante 15 días. Luego, se agregó MeJ generándose un ensayo factorial análogo al explicado anteriormente (Tabla 1). El análisis de la producción de AQs se realizó a los 15, 19, 22 y 25 días de cultivo. Análisis estadístico: se realizó por ANOVA de 2 factores y test de Tukey utilizando el programa Infostat. Resultados. Ensayos en suspensiones: Previo a la elicitación, el agregado de HPCD provocó un ligero incremento significativo en el contenido intracelular de AQs (AQs IC, 22,5%). Tanto a los 6 como a los 8 días de cultivo, se evidenció un efecto sinérgico significativo entre HPCD y MeJ, y por eso se analizó el efecto de cada factor en cada nivel del otro (Figura 1). Así, se encontró que la HPCD sólo tuvo efectos significativos en presencia de MeJ (78 y 37% a los 6 y 8 días de cultivo, respectivamente), mientras que el MeJ incrementó significativamente el contenido de AQs IC (68 y 71% a los 6 y 8 días de cultivo, respectivamente), pero aún más cuando fue agregado en presencia de HPCD (168 y 160% a los 6 y 8 días de cultivo, respectivamente). Si bien el agregado combinado de HPCD y MeJ ocasionó una cierta liberación de AQs al medio de cultivo (datos no mostrados), este efecto fue poco relevante (sólo el 6% del total de AQs producidas). Ensayos en raíces transformadas: Con respecto al contenido de AQs IC, no se evidenció el efecto sinérgico que se observó en suspensiones celulares, sino que sólo el MeJ tuvo un efecto positivo en la acumulación en todos los tiempos estudiados (Figura 2A). Con respecto al contenido de AQs extracelulares (AQs EC), se observó que el MeJ ocasionó una drástica liberación de AQs al medio de cultivo, encontrándose las mismas tanto de forma soluble como insoluble (Figuras 2B y 2C). En el caso del tratamiento combinado de HPCD y MeJ, se observó que esta proporción se invirtió, lo cual puede atribuirse a que la presencia de una CD favorece la solubilización de ciertas AQs insolubles.En estos ensayos resultó que el mayor contenido de AQs EC totales (solubles+insolubles) se encontró en el tratamiento con MeJ en ausencia de HPCD a los 10 dpe (25 días de cultivo), alcanzándose un total de 540 µmol/l (54,4% del total de AQs producidas). Por otra parte, en presencia de HPCD, la liberación de AQs provocada por MeJ fue significativamente menor (290 µmol/l; 37% del total). Este fue el único caso de interacción significativa entre HPCD y MeJ. En el resto de los tiempos analizados, sólo MeJ resultó en efectos significativos positivos sobre la producción de AQs EC totales.Conclusiones: Se demostró un efecto sinérgico entre HPCD y MeJ sobre la producción de AQs en suspensiones celulares de R. tinctorum, con incrementos de hasta un 168%, aunque no se evidenciaron efectos relevantes sobre la liberación de estos metabolitos al medio de cultivo. Por otra parte, en el caso de raíces transformadas, el MeJ resultó un potente elicitor de la producción de AQs, así como también de su liberación al medio de cultivo. El agregado combinado de HPCD y MeJ no resultó en efectos positivos en la acumulación de AQs, aunque pudo verse que la HPCD favoreció la solubilización de AQs en el medio de cultivo al ser tratadas con MeJ. Actualmente se están llevando a cabo ensayos de elicitación con MeJ y remoción in situ con Mygliol 814 en raíces transformadas de R. tinctorum.