ESTUDIOS DE INTERACCIÓN ENTRE EL FACTOR DE TRANSCRIPCIÓN HAWRKY6 DE GIRASOL Y EL RECEPTOR PUTATIVO DE ABA, UNA FITOHORMONA INVOLUCRADA EN PROCESOS DE ADAPTACIÓN AL AMBIENTE Y DE DESARROLLO EN PLANTAS

TOMASSI ARIEL H; RIBICHICH KARINA FABIANA

Santa Fe

Encuentro; Encuentro de Jóvenes Investigadores (EJI 2013); 2013

Universidad Nacional del Litoral

Las proteínas WRKY constituyen una familia de FTs particularmente expandida en plantas (Eulgem y col., 2000), que tienen en común un dominio de unión a ADN llamado WRKY, por la presencia de estos cuatro aminoácidos conservados. En nuestro laboratorio se identificaron 97 genes putativos de esta familia en girasol (Giacomelli y col., 2010). Uno de ellos, el HaWRKY6, es homólogo de tres proteínas WRKY de la planta modelo Arabidopsis, WRKY18, WRKY40 y WRKY60. (Xu y col., 2006; Pandey y col, 2009; Ulker y col, 2004). Hay evidencias bioquímicas, celulares y genéticas (Shang y col., 2010) que indican que estos tres WRKYs son reguladores negativos de la vía de transducción de señales del ácido absícico (ABA), una fitohormona clave en la respuesta a estreses abióticos y en el crecimiento y desarrollo vegetal, a través de la interacción con el dominio C-terminal de su receptor ABAR. ABAR, identificada inicialmente como CHLH o subunidad H de la quelatasa de magnesio involucrada en la síntesis de clorofila y la señalización desde el plástido hasta el núcleo, se localiza en la membrana de los cloroplastos o en el estroma dependiendo de la concentración de Mg2+. Cuando se encuentra en la membrana, ABAR posee sus dominios N-terminal y C-terminal expuestos al citosol (Shang y col., 2010; Wu y col., 2009). De acuerdo con estudios hechos en nuestro laboratorio, HaWRKY6 se localiza en el núcleo y en los cloroplastos de células de hojas de tabaco infiltradas con una construcción capaz de expresar en forma constitutiva este FT fusionado a la proteína fluorescente verde. Por lo expuesto anteriormente, HaWRKY6 sería candidato a participar de la interacción con HaABAR. Por otra parte, así como AtWRKY40, AtWRKY18 y AtWRKY60 son homólogos entre sí, y homólogos de HaWRKY6 (Giacomelli y col., 2010; Xu y col., 2006), existe al menos otro HaWRKY, HaWRKY2, también candidato a interaccionar con HaABAR, por ser ortólogo putativo de AtWRKY40, según análisis bioinformáticos realizados en nuestro laboratorio. Con el objetivo de estudiar la interacción putativa entre HaWRKY6/HaWRKY2 y HaABAR, se diseñaron ensayos de interacción in vitro por Retardo de la Fluorescencia en Geles, e in vivo por Doble Híbrido en Levaduras. Las proteínas HaWRKY6 y HaABAR fueron capaces de interaccionar en forma débil en un ensayo in vivo realizado en un sistema heterólogo, lo que es un indicio, si bien pequeño, de su interacción in planta. Si bien el ensayo in vitro dio un resultado negativo para el dominio CTD del HaWRKY6, no se pudo obtener la proteína HaWRKY6 completa, por lo que no se puede concluir que no exista una interacción entre ambos. Serían necesarios otros ensayos, como los de interacción en un sistema homólogo, para establecer si HaWRKY6 interaccionaría con HaABAR en girasol. Por otra parte, no se observó interacción entre HaWRKY2, ortólogo putativo de AtWRKY40, y HaABAR, en los ensayos in vivo e in vitro realizados. A pesar de la ortología señalada, el dominio C-terminal de HaWRKY2 es el más divergente en este grupo de FTs, lo que podría ser motivo de la ausencia de interacción con HaABAR. Las proteínas HaWRKY6 y HaABAR fueron capaces de interaccionar en forma débil en un ensayo in vivo realizado en un sistema heterólogo, lo que es un indicio, si bien pequeño, de su interacción in planta. Si bien el ensayo in vitro dio un resultado negativo para el dominio CTD del HaWRKY6, no se pudo obtener la proteína HaWRKY6 completa, por lo que no se puede concluir que no exista una interacción entre ambos. Serían necesarios otros ensayos, como los de interacción en un sistema homólogo, para establecer si HaWRKY6 interaccionaría con HaABAR en girasol. Por otra parte, no se observó interacción entre HaWRKY2, ortólogo putativo de AtWRKY40, y HaABAR, en los ensayos in vivo e in vitro realizados. A pesar de la ortología señalada, el dominio C-terminal de HaWRKY2 es el más divergente en este grupo de FTs, lo que podría ser motivo de la ausencia de interacción con HaABAR.