Caracterización por AFLP de genotipos uniformes de tomate y selección de cebadores que maximizan el polimorfismo molecular

CABODEVILA, V.G.; CACHIARELLI, P.; PRATTA, G.R.

Casilda

Congreso; XIV Congreso y XXXII Reunión Anual de la Sociedad de Biología de Rosario; 2012

SBR

El tomate cultivado (Solanum lycopersicum) es una Solanácea de gran importancia económica en el mundo. Las especies silvestres emparentadas a un cultivo representan una fuente de diversidad para incorporar a los programas de mejoramiento genético. Híbridos de Segundo Ciclo (HSC) son F1s entre líneas homocigotas élites (RILs, Recombinant Imbred Lines) que fueron derivadas de un programa de mejoramiento genético. En las generaciones segregantes de estas cruzas pueden presentarse nuevas combinaciones genéticas entre los alelos favorables acumulados en las generaciones de autofecundación y selección que condujeron a la obtención de las líneas. Su caracterización mediante el uso de marcadores moleculares permite detectar variaciones en la composición genética entre los materiales del primer y del segundo ciclo. Entre ellos, los AFLP (Polimorfismo en la Longitud de los Fragmentos Amplificados) tienen un alto poder de resolución debido a la gran cantidad de amplicones generados y a la posibilidad de usar diferentes combinaciones de cebadores. Los objetivos de este trabajo fueron caracterizar genotipos uniformes de segundo ciclo (RILs y HSC) mediante marcadores AFLP, compararlos con la variación molecular de los de primer ciclo que le dieron origen y seleccionar las combinaciones de cebadores que detecten el mayor polimorfismo entre ellos. Los materiales de segundo ciclo caracterizados fueron dos líneas recombinantes (RILs: ToUNR1 y ToUNR18) que se obtuvieron en un programa de selección divergente y antagónica, siendo el criterio de selección el mismo para ambas líneas: alto peso y larga vida poscosecha de los frutos, y el híbrido entre ellas (F1ToUNR18xToUNR1). Como testigos (materiales de primer ciclo) se emplearon a S. lycopersicum cv. Caimanta, S. pimpinellifolium LA722 y su híbrido interespecífico (F1 CaimantaxLA722), genotipos de los cuáles se derivaron las RILs. A partir del ADN extraído de los genotipos, se realizó la restricción y ligación del material, pre-amplificación y amplificación selectiva según protocolos estándares, utilizando 36 combinaciones de cebadores universales (Tabla 1). Los amplicones fueron resueltos en geles de poliacrilamida y revelados mediante tinción con nitrato de plata. Los geles se digitalizaron y fueron evaluados mediante el software GelPro. Se determinó la cantidad de bandas totales, cantidad de bandas polimórficas y porcentaje de polimorfismo para los materiales de segundo ciclo y de primer ciclo por separado a fin de comparar la variación entre ambos grupos y luego para el total de genotipos a fin de seleccionar las combinaciones de cebadores que generan mayor polimorfismo. Se calcularon los coeficientes de similitud de Jaccard y se realizó un análisis de conglomerados siguiendo un criterio de agrupamiento jerárquico a través del método UPGMA con el fin de detectar las asociaciones entre los genotipos evaluados. Se obtuvieron en total 1394 bandas, de las cuales 1060 resultaron ser polimórficas. El porcentaje de polimorfismo total fue de 76%. El polimorfismo para ToUNR1, ToUNR18 y su F1 fue de 54%, mientras que para S. lycopersicum cv. Caimanta, S. pimpinellifolium LA722 y su F1 fue de 43%. Es esperable encontrar mayor contenido de polimorfismo molecular entre los parentales originales que entre las RILs, ya que la selección artificial ejercida para la obtención de estas dos RILs de alto peso y larga vida en estantería debería haber disminuido la variación genética. Sin embargo esto no sucedió, lo que estaría indicando que existió recombinación y arreglo de genes durante las generaciones de autofecundación que condujeron a la obtención de las RILs. Las combinaciones que mayor número de bandas presentaron fueron II (134), HH (113), JJ (110), J (81), H (63) y D (50). En la combinación U no se registraron bandas. En cuanto al porcentaje de polimorfismo total, se destacaron la combinación L (100%), AA (100%), R (97%), G (95%), I (95%), C (92%), F (91%) y Q (90%) (Tabla1). Respecto al número de bandas polimórficas, presentaron mayor número las combinaciones II (100), HH (87), JJ (65), J (57), H (46) y F (42) (Tabla 1). Para seleccionar las mejores combinaciones de cebadores, es importante tener en cuenta aquéllas que produzcan un alto porcentaje de polimorfismo junto a un elevado número de bandas. Las mejores combinaciones que reunieron las condiciones anteriores, y que por lo tanto se seleccionaron, fueron los de las combinaciones F, J, H, HH, II y JJ. La Figura 1 muestra el análisis de agrupamiento. El mismo mostró una correlación cofenética de 0,925. Se observó que a una distancia de 0,73, se separan por un lado ToUNR1 y por otro todo el resto de los genotipos. A 0,57, se separan en un cluster S. lycopersicum cv. Caimanta, S. pimpinellifolium LA722 y su F1, y en otro cluster, ToUNR18 y la F1 (ToUNR18xToUNR1). Esto estaría indicando que presentan más similitud los parentales y su F1 entre ellos que las RILs y la F1 de segundo ciclo. La caracterización por AFLP reveló un amplio polimorfismo molecular, siendo mayor entre RILs y su F1 que para los materiales que le dieron origen a esas líneas y su híbrido interespecífico. También, permitió seleccionar seis combinaciones de cebadores, las cuales serán utilizadas para la caracterización de generaciones segregantes del híbrido de segundo ciclo en las que se espera detectar QTLs (Loci de Caracteres Cuantitativos) involucrados en calidad del fruto y vida poscosecha.