Ensayo de distintas condiciones de bombardeo para una eficaz transformación genética de cebada

GÓMEZ IBARRA, A.R.; SOUZA CANADA, E,D;; GUILLERMO R. PRATTA; BUSI, M,V,; PERMINGEAT, H,

Rosario

Congreso; XXIV Congreso y XLII Reunión Anual de la Sociedad de Biología de Rosario; 2022

Sociedad de Biología de Rosario

La transgénesis es una herramienta clave en el mejoramiento genético de los cultivos que depende de un conjunto de variables específicas para su éxito. En la biobalística, éstas se pueden agrupar como parámetros biológicos y físicos, asociados al explanto, al medio del cultivo in vitro, al tipo, tamaño y densidad de las partículas de bombardeo, junto con la fuerza propulsora y la distancia al objetivo, que determinan la intensidad del impacto de la partícula. Con el objetivo de mejorar la efectividad de esta técnica, se analizó la expresión transiente de la proteína verde fluorescente (GFP) sobre la superficie de escutelos maduros (EM) e inmaduros (EI) del genotipo de cebada Golden Promise (GP). La variedad se cultivó en cámaras de cultivo bajo condiciones controladas para extraer los escutelos de embriones maduros (EM) en madurez fisiología de la planta y embriones inmaduros (EI) en estado de grano pastoso (sin eje embrionario). Se bombardearon explantos en placas conteniendo 20 embriones, con 3 repeticiones de cada uno, sujetos a tratamiento osmótico pre- (4-5 h) y post-bombardeo (16 h) a distintas alturas (3, 6 y 9 cm) y presiones de bombardeo (900 y 1200 psi) con partículas de tungsteno (0,7 µm) recubiertas de un plásmido de expresión dual pGFPBAR. La eficiencia de transformación de cada uno de estos 12 tratamientos (2 explantos x 2 presiones x 3 alturas) se midió a través de la presencia de puntos fluorescentes luego de 24 h de bombardeo en un microscopio estereoscópico de fluorescencia. Se constató la expresión génica en forma de puntos fluorescentes mediante microscopía de epifluorescencia, por la cual se clasificó a los explantos en rangos de puntos fluorescentes observables que presentaban (nulos, 1-10, 10-20, 20-40, 40-60 y >60). Para detectar el mejor tratamiento, los resultados se compararon por laprueba no paramétrica del Chi cuadrado, cuyo valor calculado (X2 C = 117,1, p < 0,05) permitió detectar diferencias significativas entre tratamientos. Los mejores resultados fueron logrados con EI bombardeados a 900 psi y 6 cm de distancia, tratamiento que mostró la mayor frecuencia del máximo número de puntos fluorescentes (> 60 puntos) y el mayor número de puntos fluorescentes por explanto (en promedio: 6,91). En el caso de los EM, se evidenciaron considerables valores nulos de expresión en ambas presiones a 9 cm, pero mayores respuestas en el tratamiento con 1200 psi y 6 cm (de 1-10 a 40-60 puntos) por lo que se concluye que estos resultados constituyen un avance importante en la optimización de un protocolo eficaz para la transformación de cebada.