INTERACCIÓN ESPERMATOZOIDE-OVIDUCTO DE LLAMA. ESTUDIO DEL ΒNGF Y SU RECEPTOR TRKA

LUCIANA SARI; ANDREA E. LONGO; MARTIN E. ARGAÑARAZ; SILVANA APICHELA

Sao Pablo

Jornada; XXIV Jornadas de Jóvenes Investigadores de la AUGM; 2016

AUGM

IntroduçãoDesde el punto de vista reproductivo, los camélidos presentan características fisiológicas que difieren de las de otros tipos de ganado doméstico. Esto provoca que muchas biotecnologías que son exitosas en otros ganados, fallen al ser extrapoladas a estas especies. Una de las particularidades es que las hembras son ovuladoras inducidas, siendo la cópula responsable de la ovulación [1]. El principal factor responsable de la inducción de la ovulación se encuentra en el plasma seminal (PS) [2] .Es una proteína identificada como factor de crecimiento neural beta (βNGF). El βNGF no sólo estaría presente en el PS sino también en el mismo espermatozoide. Hasta el momento se desconoce cuál es la localización precisa del βNGF en el espermatozoide de camélidos, así como su función. ObjetivosConocer la localización de βNGF en el espermatozoide de llama y la de su receptor TrkA en el oviducto de la hembra de llama. Adicionalmente, inmnunolocalizar el βNGF a fin de conocer si el oviducto también lo produce. Material e MétodosInmunohistoquímica del βNGF en el oviducto: los cortes, de 6 um de espesor, se desparafinaron y re-hidrataron según protocolo estándar. Luego fueron incubados en buffer Tris-EDTA (pH 9) durante 10 minutos en baño de vapor. El bloqueo se realizó con Blotto durante 30 min y posteriormente los cortes se incubaron con el anticuerpo primario (anti- βNGF) (1:2000 en Blotto + 0,02% Tween) a 37°C durante una hora y luego con el anticuerpo secundario biotinilado (1/200) durante 30 min a 37ºC. Finalmente se incubó con extra-avidina/fosfatasa alcalina (1/500) durante 30 min a temperatura ambiente y se reveló con el reactivo SigmaFast.La inmunohistoquímica del TrkA se realizó de igual forma que para la marcación del oviducto con βNGF, utilizando como anticuerpo primario anti-TrKA (1:100 en Blotto + 0,02% Tween).Inmunofluorescencia del βNGF en espermatozoides: el bloqueo de uniones inespecíficas se realizó con Blotto durante 30 min a T.A. Luego, los portaobjetos fueron incubados con el anticuerpo primario (anti- βNGF) (1:2000) a 37°C durante 3 hs, y posteriormente con el anticuerpo secundario (1/200) durante 30 min a 37°C. Por último se incubaron las muestras con extravidina-FITC (1:100). Los preparados se observaron mediante microscopia de fluorescencia y fotografiaron.Siguiendo los mismos protocolos se realizaron los controles, conteniendo Blotto + 0,02% tween en lugar del anticuerpo primario. Resultados e DiscussãoSe observó que el βNGF se encuentra localizado en el espermatozoide, en la región acrosomal y en la cola, lo que podría indicar que este factor, además de inducir la ovulación como componente del PS cumpliría otras funciones asociado al espermatozoide.Por otra parte, hemos localizado el βNGF y su receptor en los distintos segmentos del oviducto de llama, observando una señal intensa y regular principalmente en el epitelio de la mucosa del oviducto. La presencia de estas proteínas en el oviducto de llama implica que ambos podrían estar jugando un papel en el transporte oviductal, fertilización, capacitación de los espermatozoides y/o desarrollo embrionario temprano. ConclusõesEn conclusión, hemos demostrado la localización del βNGF en espermatozoides de llama. Adicionalmente, localizamos el βNGF y su receptor en el oviducto de llama. Estos resultados sugieren fuertemente que el βNGF juega un rol importante en la regulación de la función reproductiva, aunque se requieren de estudios adicionales para dilucidar su función. AgradecimentosEste trabajo fue realizado gracias al apoyo de los siguientes proyectos: PIUNT 2016 A570 (UNT), BID PICT 2012-2701 (ANPCyT-UNT) y BID PICT 2013-1498 (ANPCyT-UNT).