Estabilidad de la fluorescencia en los distintos estadios biológicos de una cepa transgénica de T. cruzi (UDT TcI) que expresa la proteína GFP.

MIRANDA, CRISTIAN GABRIEL; CURTO, MARIA DE LOS ANGELES; LAMMEL, ESTELA; GONZALEZ-CAPPA, STELLA MARIS; SCHIJMAN, ALEJANDRO G.; ALBA SOTO, CATALINA D.

Buenos Aires

Congreso; XXV Reunión Científica Anual de la Sociedad Argentina de Protozoología y Enfermedades Parasitarias, Jornada Científica por el 50º Aniversario del Programa Nacional de Chagas e Instituto Nacional de Parasitología ¨Dr. Mario Fatala Chaben¨; 2012

Estabilidad de la fluorescencia en los distintos estadios biológicos de una cepa transgénica de T. cruzi (UDT TcI) que expresa la proteína GFP. Cristian G. Miranda 1, María de los Angeles Curto 2, Estela Lammel 1, Stella M. Gonzalez-Cappa 1, Alejandro G. Schijman 2, Catalina D. Alba-Soto 1. 1Departamento de Microbiología, Parasitología e Inmunología. Facultad de Medicina. Universidad de Buenos Aires. Argentina., 2Laboratorio de Biología Molecular de la Enfermedad de Chagas, INGEBI-CONICET, Buenos Aires, Argentina. Para disponer de una herramienta que permita visualizar a Trypanosoma cruzi en sus diferentes estadios biológicos hemos desarrollado parásitos genéticamente modificados que expresan proteínas fluorescentes (GFP y RFP) a partir de poblaciones parasitarias aisladas y caracterizadas en nuestro laboratorio. La cepa K98 de T. cruzi (clon de CA-I), aislada de una paciente en fase crónica de la enfermedad, pertenece a la UDT TcI, es miotrópica y no letal en el modelo murino. Esta cepa fue transfectada con el vector integrativo pTREXgfp. En este trabajo evaluamos por citometría de flujo la estabilidad de la fluorescencia en distintos estadios biológicos de T. cruzi en ausencia de drogas de selección. A partir de las cepas K98-GFP y nativa purificamos epimastigotes de cultivo axénico, amastigotes y tripomastigotes de cultivo en células Vero y tripomastigotes de sangre periférica de ratones infectados. Por citometría de flujo pudimos confirmar que la proteína codificada por el vector pTREXgfp se excita con el laser de argón (488nm) y se lee con el filtro FL1. A su vez, comprobamos que la fijación con una concentración de paraformaldehido superior al 0,5% afecta la fluorescencia. Evidenciamos que el tamaño y granularidad difiere entre los distintos estadios de T. cruzi y que el porcentaje de parásitos fluorescentes es similar en los distintos estadíos: epimastigotes (79,65%), amastigotes (76,41%), tripomastigotes de cultivo (77,47%). Además, estandarizamos el uso del citometro de flujo para detectar al parásito fluorescente en sangre periférica total sometida a lisis de glóbulos rojos. El desarrollo de parásitos transgénicos que expresan marcadores fluorescentes permitirá profundizar en aspectos como la dinámica de infecciones mixtas y la susceptibilidad a drogas tripanocidas. A su vez, el uso del citómetro de flujo automatiza el conteo de elementos parasitarios, aumenta su reproducibilidad y elimina el error dependiente del operador que involucra la microscopía convencional.