Estrongiloidosis en pacientes inmunocomprometidos: Puesta a punto de una nueva herramienta para diagnostico y seguimiento.

REPETTO, SILVIA ANALIA; ALBA SOTO, CATALINA D.; TEYELDIN, LIA; TEKIEL, VALERIA; GONZALEZ-CAPPA , STELLA MARIS

Mar del Plata

Congreso; LV REUNION CIENTIFICA ANUAL Sociedad Argentina de Investigación Clínica (SAIC); 2010

Sociedad Argentina de Investigación Clínica

S. stercoralis produce infecciones severas en pacientes (pac) que reciben corticoides. En las infecciones crónicas no complicadas un único examen de materia fecal (mf) detecta un máximo 30% de las infecciones debido a la fluctuante excreción de larvas en mf. El método de Baerman, Harada Mori y cultivo de mf en agar nutritivo (CAN) incrementan la sensibilidad diagnostica. Actualmente se considera que un paciente respondió al tratamiento cunado no se hallan larvas por los métodos diagnósticos habituales. Nosotros estandarizamos previamente el CAN lo comparamos con las técnicas de diagnóstico directo habituales (examen en fresco de mf –Ritchie). El CAN presentó una sensibilidad de 90% y valor predictivo negativo de 91% y fue de utilidad para detectar reactivación post tratamiento. Además, para determinar si los pac con parasitológicos negativos, incluían falsos negativos, desarrollamos una PCR en mf con buena específicidad para la detección de ADN de S. stercoralis en muestras de materia fecal, realizando la extracción de ADN sin el requerimiento de kits comerciales, lo cual determina un menor costo. Nuestro objetivo fue comparar los resultados de los métodos habituales, el CAN y la PCR para diagnostico y seguimiento postratamiento (pt) en pacientes inmunocomprometidos con estrongiloidosis. Para ello estudiamos tres pacientes mayores de 18 años, con Artritis reumatoidea, con antecedentes de residencia pasada en área endémica y actual fuera de ella. Para cada uno se realizó inicialmente recuento de eosinófilos, recolección seriada y en fresco de m.f. Con una muestra de m.f fresca se sembraron 3 placas de agar-nutritivo/paciente (1gr/placa) y se revisaron por 7 días. Estos procedimientos se repitieron hasta detectar el parasito en m.f. El tratamiento antiparasitario se realizó con ivermectina y se los controló por los mismos métodos a los 3, 7, 14, 30 y 60 días pt. El ADN se purificó a partir de 1g de m.f. fresca. Las muestras se incubaron 12h (T°amb) en GTES (100mM glicina, 0,05% SDS, 10mM Tris/HCL, pH:8 y 1mM EDTA 0,5M), se lisaron por congelación/descongelación y sonicación e incubaron 12 h (37°C) con buffer de lisis (100mM EDTA, 100mM NaCl, 100mM Tris pH:7,5 y 0,5% SDS, proteinasa K 100µg/ml). Luego de dos rondas de extracción con fenol: cloroformo: alcohol isoamílico (25:24:1), el ADN se precipitó con 2,5vol etanol 100% y se lavó con etanol 70% y se guardó a -20 hasta su uso. En la amplificación se emplearon: ADN 5 ul, BSA 100mg/ml, 2mM de Mg2+, 0,5μM de cada cebador (dirigidos contra 18S de rRNA), 0,4μM de dNTPs y 0,01U/μl de Taq polimerasa, en vol final: 20μl. Las condiciones de ciclado: 95ºC 3 min y 35 ciclos de 95ºC 5 s, 55ºC 1min y 72ºC 45s y con 72ºC 5min. Como control positivo se utilizó m.f contaminada con 200 larvas filariformes y como controles negativos m.f de pac sin enteroparasitosis. Resultados De los tres pacientes incluidos en el estudio, dos provenían de Argentina, y uno de Paraguay. Todos sin riesgo de infección exógena en los últimos seis años. El rango de edad fue 31-59 años. Los pac 1y 2 presentaban eosinofilia (>450 eos/mm3) asintomática y el tercero meningitis por Escherichia coli. Los tres pac recibían tratamiento con metilpregnisona. En los tres pacientes se hallaron larvas, en dos el CAN fue positivo en la segunda muestra de m.f remitida y en el tercero el diagnóstico se realizó por el examen en fresco de la primera muestra estudiada. La PCR mf amplificó una banda 100bp correspondiente a S.s en todas las muestras pretratamiento. Los pac 1 y 2 recibieron dos ciclos mensuales de ivermectina de 200 μg/kg/día dos días. El tercer pac recibió ceftriaxona 14 días y terapia combinada con ivermectina 200 μg/kg/día - albendazol 800 mg/dia una semana debido a la persistencia de larvas en m.f. Luego recibió profilaxis secundaria con ivermectina 200 μg/kg semanal. Todos evolucionaron asintomáticos, negativizaron los estudios parasitologicos pt por lo métodos habituales y los eosinófilos retornaron a valores normales. Sin embargo la PCR en las muestras pt también amplificaron una banda de 100bp, incluso en el tercer paciente con profilaxis secundaria. Conclusiones: La PCR cualitativa seria útil en el diagnostico precoz de la infección por S.s y se deberían re evaluar los métodos de cura parasitológica, ya que no detectar larvas por los métodos directos no se correlaciona con los resultados obtenidos en la PCR, aun en pacientes asintomáticos y sin eosinofilia.