INVESTIGADORES
ALBA SOTO Catalina Dirney
congresos y reuniones científicas
Título:
Estandarización de una técnica de PCR en materia fecal para diagnóstico de nematodes intestinales sin requerimientos de kits comerciales.
Autor/es:
REPETTO, SILVIA ANALIA; ALBA SOTO, CATALINA; CHIODO, PAULA; CUELLO, MARIA SOLEDAD; BASUALDO, JUAN; TEKIEL, VALERIA; GONZALEZ-CAPPA ,STELLA MARIS
Lugar:
Santa Fé
Reunión:
Simposio; XXIII Reunión Científica Anual Sociedad Argentina de Protozoología; 2009
Institución organizadora:
Sociedad Argentina de Protozoología
Resumen:
El objetivo fue poner a punto la extracción de ADN de nematodes de heces (H) y posterior PCR sobre estas muestras para diagnosticar nematodiasis. Éstas se diagnostican por enriquecimiento de H y microscopía. La sensibilidad puede ser baja y por ello las técnicas moleculares pueden ser herramientas útiles. Los métodos comunicados usan kit comerciales de purificación de ADN por las dificultades en su extracción debido a la estructura de la cutícula del parásito y por los inhibidores en H que interfieren en la PCR.. ParaPPPa  resolver esto se realizaron ensayos con nematodes y H, empleando adultos frescos de Ascaris lumbricoides (A.l) y larvas frescas de Toxocara canis (T.c) liberadas in vitro de huevos de hembras recuperadas de H de perro. Se purificó ADN de: a) 1g de  A.l ; b) 1g de A.l  más  0,5g H humanas no parasitadas: c) 400 larvas de T.c. Luego de ensayar varios protocolos, se describe el que resultó efectivo. Las muestras se incubaron a  temperatura ambiente en GTES (100 mM glicina, 0,05% SDS, 10mM Tris/HCL, pH 8 y 1mM EDTA 0,5 M) por 12 h, se lisaron mecánicamente (N2 líquido y sonicación) e incubaron a  37 C otras 12 h con  buffer de lisis (100mM EDTA, 100mM NaCl, 100mM Tris pH 7,5 y 0,5% SDS, Proteinasa K 100µg/ml). Se trataron dos veces con fenol:cloroformo:alcohol isoamílico (25:24:1) para extraer proteínas y el ADN se precipitó con 2,5 vol etanol 100%. El sedimento se lavó con etanol 70% y su concentración y pureza se verificaron por espectrofotometría. En las PCR de a), b) y c) se usaron cebadores específicos. En una cuarta muestra se combinó ADN de T.c (c) más ADN de A.l con H (b) y se amplificó con cebadores para T.c. Para la amplificación se usaron 5μl de ADN, más BSA 2,5μg, 2mM de Mg2, 0,5μM de cada cebador, 0,4μM de DNTPs y 0,01U/μl de Taq polimerasa en un vol final de 20 μl. El ciclado fue a 95 C tres min, seguidos de 35 ciclos de 95 C por cinco seg, 55 C un min y 72 C cuarenta y cinco seg y luego, 72 C cinco min. Se ensayaron muestras paralelas sin BSA. El rendimiento de ADN (μg/ml) fue: a)1,12, b) 7,78 y c) 0,176l. La relación 260/280 fue 1,7-1,8. En ausencia de BSA no se observó amplificación de ADN. Cuando se incluyó, se identificaron en a) y b) una banda de 164 bp correspondientes a A.l (rRNA 18S) y en c) y d) una banda de 364 bp correspondientes a T.c (rRNA18S). Concluimos: el tratamiento de nematodes con GTES y posterior lisis mecánica y química permite obtener ADN de calidad a partir de muestras contaminadas con H y la inclusión del BSA en las PCR neutraliza inhibidores contaminantes presentes en H. Esta metodología podría aplicarse para otras nematodiasis, como estrongiloidosis.