Caracterización de una cepa de Trypanosoma cruzi genéticamente modificada para expresar establemente la proteína fluorescente GFP.

MIRANDA, CRISTIAN GABRIEL; CURTO, MARIA DE LOS ANGELES; LAMMEL, ESTELA; SCHIJMAN, ALEJANDRO G.; GONZALEZ-CAPPA , STELLA MARIS; ALBA SOTO, CATALINA D

Hotel Golf Ascochinga, Ascochinga, Córdoba

Congreso; XXIV Reunión Científica Anual Sociedad Argentina de Protozoología; 2010

Sociedad Argentina de Protozoología

Caracterización de una cepa de Trypanosoma cruzi genéticamente modificada para expresar establemente la proteína fluorescente GFP. Cristian G. Miranda 1, María de los Angeles Curto 2, Estela Lammel 1, Alejandro G. Schijman 2, , Stella M. Gonzalez-Cappa 1, Mariano J. Levin 2, Catalina D. Alba-Soto 1. 1Departamento de Microbiología, Parasitología e Inmunología. Facultad de Medicina. Universidad de Buenos Aires. Argentina., 2Laboratorio de Biología Molecular de la Enfermedad de Chagas, INGEBI-CONICET, Buenos Aires, Argentina. En nuestro laboratorio se han aislado y caracterizado cepas que representan diferentes polos del espectro en la relación el parásito con el huésped mamífero. Con el fin de tener una herramienta que nos permita visualizar el parásito intacto y viable en diferentes tejidos y células del hospedero mamífero, hemos desarrollado parásitos genéticamente modificados capaces de expresar proteínas fluorescentes (GFP y RFP) derivados de estas cepas. La cepa K98 (clon de CA-I), pertenece al linaje TcI, es miotrópica y no letal en el modelo murino. La infección con esta cepa induce alteraciones en la fertilidad y un incremento en la tasa de resorciones fetales en hembras preñadas. K98 fue transfectada con el vector pTREXgfp, que se inserta en el locus del Promotor Ribosomal por recombinación homóloga, como se describe a continuación. Tripomastigotes sanguíneos obtenidos de ratones infectados fueron diferenciados in vitro a epimastigotes que fueron transfectados con los plásmidos por electroporación. Los epimastigotes transgénicos seleccionados en base a su resistencia al antibiótico G418 fueron clonados por dilución límite. Los parásitos G418-resistentes (≈85% de ellos fluorescentes) fueron diferenciados a tripomastigotes metacíclicos que se usaron para infectar monocapas de células Vero y ratones lactantes. Mediante este procedimiento obtuvimos tripomastigotes y amastigotes fluorescentes de la cepa K98 tanto in vitro (en líneas celulares Vero y J774) como in vivo en la infección experimental. Esta cepa, ha sido mantenida en pasajes sucesivos en ratón en ausencia de drogas de selección durante 18 meses, presentando en un alto porcentaje (78.1 % ± 5.5 S.D.) la expresión estable del gen reportero. En nuestro sistema, al igual que en otros reportes, se observa un pequeño porcentaje de parásitos G418-resistente que no expresa el marcador fluorescente. Nosotros determinamos que el porcentaje de tripomastigotes circulantes fluorescentes se mantiene constante en pasajes sucesivos o entre los diferentes ratones de un mismo pasaje. La infección experimental con parásitos K98-GFP presenta una evolución similar a la de la cepa nativa. Estos parásitos con expresión constitutiva de proteínas fluorescentes constituyen una herramienta fundamental para el estudio de la Enfermedad de Chagas en el modelo experimental  así como para la evaluación de inmunoterapias y tamizaje de nuevas drogas.